SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2701—2010 动物炭疽病检疫规范 Quarantine.protocolfor animal anthrax 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数玛防伪 SN/T2701—2010 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008年）中第2.1.1章制定，未采纳其 中的免疫荧光及疫苗制备技术内容。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国 浙江出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王海艳、姜焱、刘虹、敖威华、刘中勇、季新成、刘中学、赵林立、张晓峰、任立新。 SN/T 2701—2010 动物炭疽病检疫规范 1范围 本标准规定了动物炭疽病流行病学调查、临床症状与病理学观察、细菌学检测、Ascoli反应和聚合 酶链反应等检疫方法。 本标准适用于进出境动物炭疽病的检疫和诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室.生物安全通用要求 SN0331一1994出口畜产品中炭疽杆菌检验方法 3生物安全 炭疽为人畜共患病，试验环境和防护要求按照GB19489执行。 4培养基和试剂 4.1无菌脱纤绵羊血（或马血）。 4.2炭疽沉淀素标准抗原。 4.3炭疽沉淀素阳性血清。 4.4炭疽沉淀素阴性血清。 4.50.7%碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录A：1。 4.6 多粘菌素血琼脂平板：见附录A.2。 普通营养肉汤：见附录A.3。 4.8 普通营养琼脂平板：见附录A.4。 4.9 戊烷滕多粘菌素琼脂平板：见附录A.5。 4.10 PLET琼脂平板：见附录A.6。 4.11 碱性美蓝染色液：见附录A.7。 4.12 革兰氏染色液：见附录A.8。 4.13 洗样液：见附录A.9。 4. 14 0.5%石炭酸生理盐水：见附录A.10。 4.15 电泳级琼脂糖粉。 4.16 TaqDNA聚合酶：5U/μL。 4. 17 100bpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。 4.18 10倍浓度TaqDNA聚合酶缓冲液（10×TaqBuffer）：15mmol/L氯化镁。 4.19 dNTP混合物：脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧胸苷三磷酸（dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP)、脱 1 SN/T2701—2010 氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5mmol/L。 4.2050XTAE电泳缓冲液：见附录A.11。 4.216 6×加样缓冲液：见附录A.12。 4.22 溴化乙锭溶液：见附录A.13。 5设备和材料 5.1 恒温培养箱。 5. 2 二氧化碳培养箱。 5.3 恒温水浴箱。 5. 4 生物显微镜。 5.5 Ascoli反应管（小试管，内直径约0.5cm左右）。 5. 6 高压灭菌器。 5.7 微量加样器。 5.8 高速冷冻离心机。 5.9 PCR仪。 5. 10 水平凝胶电泳槽。 5. 11 电泳仪。 5.12 凝胶成像系统。 6 临床症状 依据本病流行病学调查、临床症状和病理学观察结果初步作出判定，见附录B。 7实验室检测 7.1新鲜样品检测 7.1.1组织液涂片 取活体动物耳部血液、病变部位的水肿液或渗出液制作涂片或取刚死亡动物末梢血制作涂片。自 然干燥后，火焰固定，备用。 7.1.2血液琼脂平板培养 取血液、水肿液、渗出物以及组织或器官切面上采集的拭子直接接种含有多粘菌素(100000IU/L) 的5%～7%马血（或羊血）血平板表面，置37℃培养18h～24h。在血液琼脂平板上，炭疽杆菌呈灰白 色至灰色菌落，直径为0.3mm～0.5mm，不溶血，表面潮湿似毛玻璃样，不透明，无光泽，边缘不整齐。 用放大镜观察，边缘呈卷发状。用接种环探触有粘滞感，挑之可拉起长丝。 7.1.3营养肉汤培养 取血液琼脂平板上的典型菌落接种营养肉汤，于37℃培养5h12h。炭疽杆菌在肉汤中生长的 初期特征是肉汤上部澄清，无菌膜，下部有絮状沉淀，沉淀不易摇散。 7.1.4’英膜诱导培养 取血液琼脂平板培养的典型菌落或营养肉汤培养物接种于含0.7%碳酸氢钠的营养琼脂平板，置 2 SN/T 27012010 20%二氧化碳培养箱中培养18h～24h，取菌落涂片，火焰固定，备用。 7.1.5染色镜检 7.1.5.1革兰氏染色 取血液琼脂平板上的典型菌落或肉汤培养物制备涂片，火焰固定。结晶紫染色1min，水洗，革兰 氏碘液染色1min，水洗，95%酒精脱色30s，水洗，沙黄复染30s，水洗，干燥，镜检。 炭疽杆菌为革兰氏阳性菌，多个菌纵向连成长链，少数散在，菌体呈两端平齐的大杆状。有的菌体 中央可见卵圆形不着色的芽孢，芽孢不使菌休膨大。 7.1.5.2英膜染色 取已固定好的血液、水肿液或渗出液、英膜诱导培养物涂片，滴加一小滴碱性美蓝染色液染色 1min，水洗、晾干、镜检。炭疽杆菌在低倍镜下呈短链状排列，在油镜下菌体粗大呈竹节状排列，菌体呈 深蓝色或黑色，菌体周围的荚膜呈粉红色。 7.2陈旧、腐败脏器、动物尸体和环境样品(包括土壤)的检测 采集样品25g左右，将其与两倍休积的灭菌蒸馏水或去离子水混合，于63℃水浴15min。然后稀 释至10-²或10-3。取每个稀释度的样品稀释液100μL涂布于血琼脂平板，取250μL～300μL涂布于 PLET琼脂平板，置37℃温箱中培养。血琼脂平板培养18h～24h、PLET琼脂平板培养24h～48h。 挑取可疑菌落按7.1.3、7.1.4、7.1.5.的方法进行鉴定 7.3畜产品检测 7.3.1细菌学检测（按照SN0331/1994中第4障、第5章、6.1、6.2和6.3的内容执行） 7.3.1.1抽样 毛绒和骨粒按生产日期或原料来源划分批次。每批按30%开包（箱)抽样或在扎包（装箱)时由每 包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）的不部位共抽样3g～5g，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎 紧，作上批次标记。将样品装入塑料袋或铁筒内，密封后送样。 动物皮张应逐张取样。用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管，塞紧棉塞。将试管 逐支用纸包裹，装入铁筒内，再用棉花或软纸填充空隙，密封后送样。 7.3.1.2样品处理 验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取1g～2g样品，一起放入一 个适当大小的灭菌三角瓶中。 加样品量30倍～40倍（质量浓度）的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严。将三角瓶冰 水浴或0℃～4℃冰箱内，间或摇动约1h。 将瓶中洗样液倒人500mL灭菌离心管中，盖住管口，以3000r/min离心20min。充去上清液，加 少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置5min10min，待杂质下沉后，将上悬液移人另一支灭 菌试管内，于65℃恒温水浴加热30min。 加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内，以防芽孢发芽。 7.3.1.2.2动物皮张的棉拭子涂抹样品，如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内，以防芽孢 发芽。 3 SN/T2701—2010 7.3.1.3检验方法 按7.3.1.2处理后的毛绒和骨粒样品悬液，根据每管所包括样品份数之多少，各接种1个～3个溶 菌酶多粘菌素平板或戊烷多粘菌素平板。接种时用灭菌吸管吸取样品，滴加于平板表面，各0.1mL～ 0.3mL。如有剩余样品，可增接数个平板，直至将样品接种完。用灭菌L型玻璃棒将滴加的样液涂布 均匀。如样液较多，可将平板置于37℃温箱，微开血盖，使样液迅速干燥。翻转平皿，置于37℃恒温 箱，培养48h～72h。挑取可疑菌落按照7.1.3、7.1.4、7.1.5的方法进行鉴定 动物皮张的棉拭子涂抹样品，将棉拭子由试管内取出，各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷多 粘菌索平板。翻转平皿，置于37℃恒温箱，培养24h～48h。挑取可疑菌落按照7.1.3、7.1.4、7.1.5 的方法进行鉴定。 7.3.2Ascoli反应 7.3.2.1样品采集 被检皮张、原毛应存放于专用仓库和指定的地方，不同批次的皮张、原毛分开存放。每批放在一处， 每张皮张编号，原毛独立包装编号。在每张皮的腿部或腋下剪取样皮一块约2g，原毛在各独立包装取 样3.g，若无独立包装则在分散的20个以上不同点各取样3g。样皮、样毛应装入专用的密封金属盒或 耐高温防水样品袋中，并按原有号码编号。 7.3.2.2样品消毒 将检验样本连同样品袋一起放入高压灭菌器，1.034×105Pa消毒30min。冻皮、湿皮、鲜皮应在 高压消毒前置室温48h。 7.3.2.3被检样本制备 将经高压消毒的皮样去除脂肪，剪取皮样1cm²或原毛数克放到浸样瓶中，并记录样品编号和相对 应的浸样瓶编号。按照质量：体积=1：5～1：10的比例加人0.5%石炭酸生理盐水至浸样瓶，放4℃ 冰箱浸泡16h～24h后，用中性滤纸滤过浸液，其澄清液为被检样本抗原，待检。 7.3.2.4正式试验 7.3.2.4.1炭疽沉淀素阳性血清对照试验 先将炭疽沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加人斜置的Ascoli反应管中，达到管高的三分之一处，然后 吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管壁慢慢注入到沉淀素阳