SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2695—2010 杀鲑气单胞菌的检验操作规程 Protocol of detection for Aeromonas salmonicida 2010-11-01 发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2695—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参照了美国渔业协会的《鱼类某些病原的检测和鉴定程序》（ProceduresfortheDetection andIdentification of CertainFishPathogens)2o06版中“痧疮病”（Furunculosis)一节。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：张立怀、岳志芹、陈本龙、霍蕾、王建华、侯艳梅。 SN/T 2695—2010 杀鲑气单胞菌的检验操作规程 1范围 本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。 本标准适用于进出口鱼苗、幼鱼和成鱼的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3设备材料 3.1材料 3.1.1月 胰蛋白陈大豆蛋白陈琼脂（TSA）：见附录A.1实验用水应符合GB/T6682规定。 3.1.2 胰蛋白陈大豆蛋白陈血琼脂（TSA-B)：见附录A.2。 3.1.3月 脑心浸液琼脂（BHIA）：见附录A.3。 3.1.4 脑心浸液血琼脂平板(BHIA-B)见附录A.4。 3. 1.5 胰蛋白陈大豆蛋白陈肉汤（TSB）：见附录A.5。 3.1. 6 考马斯亮蓝（CBB)：分析纯、 3. 1.7 微量生化反应管。 特异性抗血清。 3.1.8 3.2设备 3.2.1 PCR仪。 3.2.2电泳仪。 3.2.3凝胶成像系统。 3.2.4生化培养箱：一5℃～50℃±1℃。 3.2.54 生物安全柜。 3.2.6 解剖器械。 4样品的采集 4.1无临床症状鱼，无菌采集其肾、肝、脾等。 4.2对于体表有临床症状的鱼，可以采集其病灶深处的组织。 1 SN/T 2695—2010 5细菌分离鉴定 5.1样品的接种 用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在TSA或BHIA上划线。推荐接种在相应血琼脂平板 TSA-B或BHIA-B上，于20℃～25℃培养48h。从金鱼、鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时，用拭子或接 种环取样接种到TSA-B或BHIA-B上，于20℃～25℃培养48h。 为便于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落，可在培养基中加人0.1%的考马斯亮蓝（CBB）。 杀鲑气单胞细菌在含0.1%CBB的TSA或BHIA培养基上为深蓝、深紫色易碎的菌落，无毒力的菌株 在该平板上为无色的菌落。 5.2杀鲑气单胞菌的初步判定 杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的（0.8μm～1.3μm）×（1.3μm～2.0μm)杆菌或球杆菌，两极 浓染。无运动性，色素氧化酶绝天多数阳性。天多数产生弥散性棕色色素，发酵葡萄糖。在TSA-B或 BHIA-B上，菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。 5.3玻片凝集试验 初步判定为杀鲢气单胞菌的菌株，可以用杀鲤气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在十净的载 玻片上，加一滴生理盐水和一滴抗血清，取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀，3min内观察是 否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集，在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如 果细菌在生理盐水中凝集，则该菌为自凝菌株，不适用本试验鉴定。 5.4细菌的PCR鉴定 5.4.1引物 杀鲑气单胞菌VapA基因扩增的参考序列参见附录B。按照表1设计引物。 表 1 PCR 引物序列 靶基因 引物序列号 引物序列 PCR产物大小 AP-1 5'-GGCTGATCTCTTCATCCTCACCC-3 表面阵列蛋白 (1085-1108) 421 bp AP-2 基因（VapA） 5"-CAGAGTGAAATCTACCAGCGGTGC-3" (1505-1482) 5.4.2模板的制备 对于分离的菌株，采用粗提的DNA进行鉴定。将平板上的菌落取1接种环，加到200μL的无菌去 离子水中，摇匀后，在95℃热处理5min，置冰上冷却。13000g离心30s，取上清液用于检测。用已知 杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照，用无菌去离子水作阴性对照。 细菌DNA的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。 5.4.3DNA扩增 采用20μL反应体系： 2 SN/T 2695—2010 10XPCR缓冲液 2 μL MgCl² (25 mmol/L) 2 μL dNTP混合物(10 mmol/L) 2 μL 引物AP1(5μmol/L） 2 μL AP2(5μmol/L) 2 μL 模板DNA 2 μL TaqDNA聚合酶（5U/μL) 0. 2 μL 7.8 μL 灭菌去离子水 循环参数为：94℃3min;94℃变性30s，57℃退火30s73℃延伸45s，35个循环。73℃延伸10min。 5.4.4 电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，加人最终浓度为1μg/mL的漠化乙锭。用100bp DNAladderMarker作为对照，对PCR产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无421bp大小的特异 性条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。 5.4.5 结果判定 阴、阳性对照成立，PCR检测检出特异条带的样品，判为条鲑气单胞菌PCR检测阳性， 亚种确定 初步判定为杀鲑气单胞菌后，可以进一步按表2进行生化试验，确定其亚种。 表2杀鲑气单胞菌不同亚种的生化特性 Aeromonas salmonicida subp. 生化特性 salmonicida masoucida achromogenes smithia 吲哚 + + 甲基红 + + + 一 V-P 一 + 硫化氢产生 一 一 + + 赖氨酸脱羧酶 d p d + + [] 精氨酸双水解酶 + D-葡萄糖产酸 + + + [+] D-葡萄糖产气 + + [+] L-阿拉伯糖产酸 + + D-乳糖产酸 + + + 甘油产酸 d d d [] 麦芽糖产酸 + + + 一 D-甘露醇产酸 + + 蔗糖产酸 一 + + d 海藻糖产酸 + + + 七叶苷水解 + + 3 SN/T 2695—2010 表2（续) Aeromonas salmonicida subp. 生化特性 salmonicida achromogenes masoucida smithia 脂肪酶(玉米油) + 十 ONPG d p p + 棕色色素 + 注： 十：90%以上菌株呈阳性反应 ［+]：76%～89%菌株呈阳性反应。 一：90%以上菌株呈阴性反应。 ［-］：11%～25%菌株呈阳性反应。 d:11～89菌株呈阳性反应。 V：反应不稳定。 a生化试验的进行，可以参照购买的生化试剂使用说明书。应培养48h判定结果 6结果判定 6.1分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，与特异性抗血清凝集，符合杀鲑气单胞菌特性的，报告杀鲑气单 胞菌检测阳性。 6.2分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，PCR检测为阳性的，报告杀鲑气单胞菌检测阳性。 6.3分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，经进一步生化试验，符合杀鲑气单胞菌发生特性的，判定杀鲑气 单胞菌检测阳性。 6.4未分离出细菌、所分离菌不符合杀鲑气单胞菌特性的，判定杀鲑气单胞菌检测阴性。 SN/T2695—2010 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)的配制 15.0 g 胰蛋白陈 5.0g 大豆蛋白 5.0 g 氯化钠 琼脂 15. 0 g 蒸馏水 1 000 mL 先将以上成分溶解，调好pH到7.3士0.2，121℃高压灭菌15min，倒平板。也可使用合格的等效 成品培养基。 A.2胰蛋白陈大豆血琼脂平板(TSA-B)的配制 15.0 g 胰蛋白陈 5.0g 大豆蛋白陈 5.0 g 氯化钠 15.0 g 琼脂 蒸馏水 1000mL 先将以上成分溶解，调好pH到7.3士0.2，121℃高压灭菌15min，将灭菌后的TSA冷却至50℃ 左右时，加入终浓度为5%的马血，混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。 A.3脑心浸液琼脂平板(BHIA)的配制 牛心粉 8.0 g 18.0 g 胰蛋白陈 酵母提取物 2.0g D-葡萄糖 1.0 g 0.05 g 高铁血红素 维生素K 0. 005 g 0.5g 盐酸半胱氨酸 氯化钠 5.5 g 2.5 g 磷酸氢二钾 刃天青 0.001 g 琼脂 15. 0 g 蒸馏水 1 000 mL 将上述成分溶解后，115℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右时，倒平板。也可使用合格的等效成 品培养基。 5