SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2694—2010 牛胎儿毛滴虫检验方法 Protocol of detection for Tritrichomonas fetus in bovine 2010-11-01 发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2694—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 有关章节，参照了加拿大动物疾病研究所的操作规程。 本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局 本标准主要起草人：张立怀、王建华、陈本龙、霍蕾、侯艳梅 I SN/T2694—2010 牛胎儿毛滴虫检验方法 1范围 本标准规定了牛胎儿毛滴虫的病原鉴定和PCR检测方法。 本标准适用于进出口牛、牛精液中胎儿毛滴虫的检疫。也适用于牛场胎儿毛滴虫病的监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3概述 胎儿毛滴虫（Tritrichomonasfetus）引起牛生殖道毛滴虫病，造成奶牛流产和不育。牛是胎儿毛滴 虫的自然宿主，猪、马、獐也可能是它的自然宿主。在肉牛群中，或在人工授精技术尚未广泛应用的地 方，该病仍然十分严重。该病是世界动物卫生组织规定的二类病。该病原体有三个血清型，分别是贝尔 检查传播。 4设备与器材 4.1采样管和吸球，采样管为中空的塑料长管，采样端钝，另一端可与吸球相连 4.2剪刀、记号笔、一次性手套、防护服、吸水纸、桶、消毒液。 4.3生物安全柜。 4.4培养箱。 4.5普通生物显微镜。 4.6台式离心机。 4.7基因扩增仪。 4.8水浴锅。 4.9涡旋振荡器。 4.10冰箱。 4.11琼脂糖凝胶电泳仪。 4.12凝胶成像分析系统。 5培养基及试剂 除特殊说明外，试验用水应符合GB/T6682规定。 5.1胎儿毛滴虫运输培养基（TFTM)（见附录A.1）。 5.2胎儿毛滴虫培养基：Diamond培养基（见附录A.2）。 5.3吉姆萨染液（见附录A.3）。 1 SN/T 2694—2010 5.4裂解液（见附录A.4）。 5.5酚/三氯甲烷/异戊醇25：24：1。 5.63mol/L乙酸钠（见附录A.5）。 5.7TE缓冲液。 5.8阳性对照：由指定单位供应。 6样品采集 6.1公牛的阴茎包皮清洗液的采集 公牛用六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外面的阴毛，用清水洗净公牛的尿道口，并 用纸擦干。将采样管的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压扁，用10mL预热至35℃左右的生理盐 水反复冲洗，吸取冲洗液。取出采样管，迅速将冲洗液注入无菌15mL离心管中。将采样管放入消毒 液中。冲洗液静置15min～20min，用一次性吸管吸取底部液体1mL，分别注入两瓶TFTM中， 0.5mL/瓶。18℃～37℃条件下，尽快送至实验室。 6.2母牛的生殖道清洗液、阴道粘液的采集 母牛六柱栏保定，用清水洗净牛的外阴部，将采样管的采样端插人阴道内，用10mL预热至35℃ 左右的生理盐水冲洗，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样管，迅速将冲洗液注 部液体1mL，分别注入两瓶TFTM中，0.5mL/瓶。18℃～37℃条件下，尽快送至实验室。 6.3流产的胎儿样品采集 无菌采取胎儿的胃内容物1mL，0.5mL/瓶，分别注入两瓶TFTM中，18℃～37℃条件下，尽快 送至实验室。 6.4精液的采集 人工采集的新鲜或冷冻精液，取1mL置2瓶TFTM中，0.5mL/瓶。尽快送至实验室 7虫体的培养与镜检 1滴2滴沉淀物至载玻片上，不盖盖玻片，10×镜下观察。 7.2如未发现虫体，另取2滴～3滴沉淀物接种到含10mLDiamond培养基的试管中。接种时，应将 沉淀物接种在培养液的上层近液面处。37℃培养7d。 7.3分别在第2、4、5、7天从管底部取一滴检查。检查方法同7.1。 7.4发现虫体后，推荐用吉姆萨染液染色后观察。将待检样品取一滴，置于载玻片一端，用另一片载玻 片推成薄膜，室温下干燥，用甲醇固定2min，将载玻片浸人含吉姆萨染色液的染色缸中，染色30min。 取出后，吸干多余染液，在40×倍物镜下观察。 8虫体的鉴定 8.1形态学鉴定 胎儿毛滴虫是一种有鞭毛、呈梨状的真核原生动物。具有三根前鞭毛、一根后鞭毛和波动膜，体长 约8um～18um、宽4um～9um，呈活泼的蛇形运动。虫体前半部有核，有1个不易观察到的胞质体 2 SN/T 2694—2010 和副基体。有鞭毛4根，3根向前游离与体长相等；1根向后沿波动膜延伸，出虫体后成游离鞭毛。波动 膜有3个～6个弯曲。虫体中央有一条纵走的轴柱，起始于虫体前端，沿体中线向后延伸，其末端突出 于体后端。虫前端与波动膜相对的一侧有半月状胞口（参见附录B）。 8.2PCR鉴定 8.2.1引物序列 胎儿毛滴虫扩增引物序列见表1。 表1胎儿毛滴虫扩增引物序列 靶基因名称 序列号 引物序列 扩增片段大小/bp TFR3 5"-CGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACC-3 5.8SrRNA基因 347 TFR4 5'-CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA-3* 8.2.2虫体DNA的制备 取可疑虫体样品500uL，3000r/min离心5min，弃上清液。将沉淀用100μLPBS重新悬浮。加 100μL细胞裂解液，在涡旋振荡器上振荡10s混匀，12000r/min离心5min，取上清液，用等体积的 25：24：1的酚/三氯甲烷/异戊醇抽提样本。取上层水相到新离心管中。加等量冰冻异丙醇和0.1倍 体积的3mmol/L乙酸钠，置一20℃2h或过夜，沉淀DNA。12000r/min4℃离心10min，倒掉上清 10μLTE，备用。 取标准虫体作阳性对照。 也可采用等效DNA提取试剂盒提取虫体DNA。 8.2.3PCR扩增 采用50μL反应体系。引物TFR3、TFR4终浓度为1.0μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，dNTPs终 浓度为200umol/L，氯化镁终浓度为1.5mmol/L，热启动Taq聚合酶2U，模板（虫体DNA）5uL，无 菌去离子水补足体积至50uL。 循环参数：95℃10mm；94℃30s，67℃30s，72℃90s，40个循环；然后72℃延伸15min。 8.2.4结果观察 用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物。在凝胶成像系统中观察有无347bp大小的特异性条 带。如有必要应进行测序。序列参见附录C。 9PCR检测方法 送达实验室的样品，不经虫体培养，直接用PCR方法检测。操作程序同8.2。 10结果判定 10.1在连续7d培养观察中，任何一次镜检中发现病原，判定样品胎儿毛滴虫检测阳性。 10.2用PCR直接检测样品，若阳性对照成立，从样品检测结果为阳性，判定胎儿毛滴虫PCR检测阳 性，否则判定胎儿毛滴虫PCR检测阴性。 10.3如至第7天镜检仍未发现病原，PCR检测为阴性，判定样品胎儿毛滴虫检测阴性。 3 SN/T2694—2010 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1胎儿毛滴虫运输培养基（TFTM） 硫乙醇酸盐培养基 29.8 g 蒸馏水 1 000 mL 115℃高压后，冷却至56℃加入： 灭能牛血清 100 mL 青霉素 100000U 链霉素 1g 真菌抑制剂 2 mL 将培养基混匀后分装到10mL的灭菌试管中，每管5mL，置冰箱中冷藏，应2周内使用。 A.2 改良Diamond培养基 2 g 胰蛋白 酵母提取物 1g 0.5 g 麦芽糖 0.1 g 盐酸半胱氨酸 抗坏血酸 0.02 g 0.08 g 磷酸氢二钾 0.08 g 磷酸二氢钾 蒸馏水 90 mL 清（56℃加热30min)10mL。 青霉素G粉 100000U 0.1 g 硫酸链霉素 每管10mL分装。4℃保存备用。 A.3吉姆萨染液 吉姆萨色素 0.6 g 甘油 50 mL 甲醇 50 mL 将吉姆萨染料加人甘油中，于55℃～60℃下加热1.5h～2h后，再加甲醇50mL数天后过滤，即 为原液。使用时，将其稀释20倍作为工作液。 A.4细胞裂解液 100 mmol/L Tris-HCl pH8. 0 4 SN/T 2694—2010 25 mmol/L EDTA pH8. 0 0. 5 % SDS 0.1 mg/mL 蛋白酶K 3mol/L乙酸钠 A.5 冰乙酸调节pH值至5.2，加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌后，室温保存 5