SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2552.5--2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第5部分：沙门氏菌检验 Microbiological examinatiom methoai for milk and milk products hygiene- Part 5: Detection nf Salmonella spp. (ISO 6785:2001,Milk and milk products --Detection of Salmonella spp.,MOD) 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民建和国 数码防伪 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2552.5---2010 前 SN/T2552《乳及乳制品卫生微生物学检验方法》分为十三个部分： 第1部分：取样指南； 第2部分：检验样品的制备与稀释； 第3部分：酵母、霉菌菌落计数； -第4部分：嗜冷菌微生物菌落计数 第5部分：沙门氏菌检验； 第6部分：柠檬酸杆菌检验； -第7部分：阴沟肠杆菌检验； -第8部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验； 第9部分：克雷伯氏菌检验， 第10部分：阪崎肠杆菌检验 免疫荧光法； 第11部分：蜡样芽孢杆菌的分离与计数； 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数； 第13部分：假单孢菌属的分离与计数。 本部分是SN/T2552的第5部分， 本部分按照GB/T1.1---2009给出的规则志草。 本部分修改采用了ISO6785：2001《Milkaudmilkproducts--DetectionofSalmonellaspp.》，与其 主要差异如下 按照GB/T1.1标准要求和汉语习惯对：些编排格式进行了修改： 将一些适用于国际标准的表述改为适用干我国标准的表述。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分由中国检验检疫科学研究院负责起草 本部分主要起草人：赵贵明、刘振、李瑾、于负、赵勇胜、刘沛、杨海荣、袁飞。 SN/T2552.5---2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第5部分：沙门氏菌检验 范围 SN/T2552的本部分规定了乳粉中沙门氏菌检验方法。 本部分适用于乳粉中沙门氏菌的检验，其他乳.制品可参照使用。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包拓所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2552.1乳及乳制品卫生微生物学检验方法第1部分：取样指南 SN/T2552.2乳及乳制品.卫生微生物学检验方法 第2部分：检验样品的制备与稀释 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 沙门氏菌Salmonella spp. 接种选择性平板上生长，菌落典型且其符合沙门氏菌属生化和血清学特征的微生物。 3.2 沙门氏菌显色培养基 Chromogenic Salmonella Mediuma 一种根据沙门氏菌属产C8酯酶或其他特异性酶的特点，在培养基中加入相应显色底物，沙门氏菌 生长分解该底物使其菌落显现特有颜色的·类选择性培养基。 设备和材料 4.1天平：感量0.1g。 4.2 均质器：拍击式或蠕动式。 4.3 培养箱：37℃士1℃。 4.4 高压湿热灭菌锅：115℃~121℃。 4.5 水浴锅：41.5℃±1℃、37.5℃±1℃、55℃J1℃。 4.6pH计：25℃测量，精度±0.1pH单位。 4.7 刻度吸管或自动移液器：容量1mL和10ml，分度分别为0.5mL和0.1mL。 4.8 无菌平Ⅲ：直径90mm或100mm。 4.9 量筒。 培养基和试剂 5.1 缓冲蛋白陈水：见附录A第A.1章。 SN/T2552.5-2010 RVS培养基：见附录A第A.2章 5.2 5. 3 亮绿酚红培养基：见附录A第A.3章 5. 4 亚硒酸盐胱氨酸培养基(SC)：见附录A第A.4章。 5.5 尿素酶琼脂：见附录A第A.5章。 5. 6 L-赖氨酸脱羧培养基：见附录A第A.6章 5.7 三糖铁琼脂（TSI琼脂）：见附录A第A.7章。 5. 8 ONPG培养基：见附录A第A.8章 VP培养基：见附录A第A.9章 5.9 5.10 胰蛋白陈培养基：见附录A第A.10章 5.11 半固体营养琼脂：见附录A第A.11章。 5. 12 血清：见附录A第A.12章。 5.13 Voges-Proskauer(VP)试剂：见附录A第A.13章。 5.14 Kovac"s试剂：见附录A第A.14章 5.15 ESMTM沙门氏菌显色培养基。 6取样 取样和样品运送按SN/T2552.1规定执行。 7 操作步骤 7.1 样品制备 录B。 7.2增菌培养 7.2.1 前增菌培养 称取样品（25g或25mL）加入到225mL缓冲蛋白陈水进行前增菌培养，培养条件：37℃培养 16h20h. 7.2.2选择性增菌培养 转接0.1mL7.2.1前增菌培养液至10ml.RVS培养基，于41.5℃培养18h～24h，或者取10mL 上述前增菌培养液至100mLSC中.于37℃培养18h～24h。 7.3分离培养 将选择性增菌培养液划线接种至沙门氏菌显色培养基平板上，同时接种其他沙门氏菌分离培养基 上（如：亮绿酚红琼脂），于37℃培养18h24h。 观察有无可疑沙门氏菌生长。若未发现可疑，则继续 培养18h24h，再进行观察。沙门氏菌在显色培养基L的典型菌落呈紫红色菌落，颜色有深浅，在亮 绿酚红琼脂培养基上菌落呈无色。周围培养基为亮红色。 给出这-信息是为了方便本部分的使用者，并不 1）ESMTM沙门氏菌显色培养基是适合的市售产品的实例之 表示对这一产品的认可。 2 SN/T2552.5---2010 7.4确证 7.4.1 可疑菌落的挑取 接种针挑取平板上5个可疑菌落，若平板上可疑菌落少于5个，全部挑取准备以下生化试验。 7.4.2生化确证 7.4.2.1 接种三糖铁琼脂（TSI琼脂） 采用斜面划线，底层穿刺的方式接种TSI琼脂.37C培养24h，观察结果，底层斜面颜色呈红色或 颜色无变化，则不利用葡萄糖、乳糖和蔗糖。如果底层变黑，则产H,S反应阳性。如果底层变黄产气斜 面颜色呈红色或无变化，则葡萄糖利用阳性。 7.4.2.2接种尿素酶琼脂 划线接种至尿素酶琼脂斜面，37℃培养24h，观察斜面颜色变化，若呈酚红至玫瑰红色，反应呈阳 性；若颜色无变化，则反应呈阴性。 7.4.2.3 接种L-赖氨酸脱羧培养基 接种至赖氨酸脱羧液体培养基，37℃培养24h，观察培养液的颜色，若呈紫色，反应阳性；若呈黄 色，反应为阴性。 7.4.2.4接种ONPG培养基 排取可疑单菌落，加人到含有0.25mL盐水（0.85%)的小试管中，制成菌悬液。取一滴菌悬液加 人到含ONPG的培养管中，37℃培养18h～24h，观察结果，阳性反应，试剂变黄，阴性反应不变色。 7.4.2.5 接种VP培养基 挑取单个可疑单菌落接种至含有VP培养基的培养管中，37℃培养24h，然后依次滴加3滴萘酚乙 醇溶液和2滴氢氧化钾溶液，观察实验结果，15min内呈红色，则为阳性反应；反之为阴性反应。 7.4.2.6 接种吲哚培养基 Kovac氏试剂，观察结果，液面呈现红色环，则为阳性反应；液面呈现黄色环则为阴性反应。 7.4.2.7沙门氏菌生化结果 典型沙门氏菌生化试验结果判断如表1所示。 表1 典型沙门氏菌生化反应 确证试验 南性或阴性反应 生化反应阳性率 TSI底层变黄（利用葡萄糖产酸） 100 TSI产气(利用葡萄糖产气) 91. 9 TSI斜面呈红色或不变色（乳糖/薰糖阴性） 99.2/99.5 TSI产H,S 91.6 尿素分解 100 I-赖氨酸脱羧 94. 6 3 SN/T2552.5--2010 表1 典型沙门氏菌生化反应（续） 生化反应阳性率 确证试验 阳性或阴性反应 98.5 β半乳糖苷酶反应 VP反应 100 98.9 吲哚反应 注：Salmonellaenterica亚种Salmonellarizonge及Salmonelladiarizonae乳糖利用阴阳性反应不定，但β-半乳 糖苷酶反应总是阳性。沙门氏菌亚属Ⅱ乳籍利用反应阴性，但β-半乳糖苷酶反应可能为阳性 7.4.3 血清学确证 7.4.3.1 总的原则 玻片凝集试验，消除自凝集反应后，采用相应的杭.血清检测沙门氏菌O-、Vi一和H一等抗原。 7.4.3.2 自凝集反应消除 小心滴加一滴盐水于载玻片的一端.挑取可以沙门氏菌单菌落与盐水混合成均匀菌悬液，轻轻晃动 载玻片30s～60s，在暗背景下观察试验现象，若出现可见的菌体凝集，则视为自凝集阳性。自凝集阴性 的菌进行血清学鉴定参照下面方法。 7.4.3.30抗原检测 选取非自凝集的菌株进行O抗原测试.按7.4.3.2所述方法，以抗O血清（单价或多价）替代盐水 进行试验。 7.4.3.4Vi抗原检测 选取非自凝集的菌株进行Vi抗原测试·按7.4，3,2所述方法，以抗Vi血清代替盐水进行试验。 7.4.3.5H-抗原检测 挑取纯的非自凝集沙门氏菌可疑菌落穿刺接种至半固体培养基中，然后放置培养箱37℃培养18h～ 24h，观察结果。按照7.4.3.2所述方法，以抗11血清代替盐水进行试验。 7.4.3.6 血清结果判读 表2给出了血清学确证试验结果判读标准。可疑菌落进行血清学试验按此表进行判断。 表2 血清学确证试验结果判读 血清学反应 结果判断 生化反应 自凝集反应 O、Vi或H抗原阳性 沙门氏菌 反应典型 反应典型 所有反应为阴性 不测