SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2552.13—2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第13部分：假单孢菌属的分离与计数 Microbiological examination for milk and milk products hygiene- Part 13 :Isolation and enumeration of Pseudomonas spp. 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2552.13—2010 前言 SN/T2552《乳及乳制品卫生微生物学检验方法》分为十三个部分： 第1部分：取样指南； 第2部分：检验样品的制备与稀释； 第3部分：酵母、霉菌菌落计数； 第4部分：嗜冷菌微生物菌落计数； 一第5部分：沙门氏菌检验； 第6部分：柠檬酸杆菌检验； -第7部分：阴沟肠杆菌检验； 第8部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验； 第9部分：克雷伯氏菌检验； 第10部分：阪崎肠杆菌检验 免疫荧光法； 第11部分：蜡样芽孢杆菌的分离与计数； 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数； 第13部分：假单孢菌属的分离与计数。 本部分是SN/T2552的第13部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分参照了ISO13720：1995《肉及肉制品假单胞菌属计数方法》（MeatandmeatproductsEnu- meration of Pseudomonas spp.)。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：赵贵明、赵勇胜、郑晶、黄晓蓉。 SN/T2552.132010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第13部分：假单孢菌属的分离与计数 1范围 SN/T2552的本部分规定了乳及乳制品中假单孢菌属的分离与计数方法。 本部分适用于乳及乳制品中假单孢菌属的分离与计数。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2552.1乳及乳制品卫生微生物学检验方法第1部分：取样指南 SN/T2552.2乳及乳制品卫生微生物学检验方法．第2部分：检验样品的制备与稀释 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 假单孢菌属Pseudomonasspp. 按照该项标准操作、25℃培养，在CFC琼脂上形成菌落的一类菌。 4.原理 4.1样品处理 如果样品为液体，平行接种一定数量试验样品于固体选择性平板；如果样品为固体，则首先将样品 制成悬液，接种样品后于25℃下需氧培养48h。 4.2假单孢菌属数量计算 从平板上挑取菌落经氧化酶试验和克氏双糖铁试验确证后，计算获得每毫升、每克样品中假单孢菌 属数量。 设备和材料 5.1水浴箱：水温45.5℃±0.2℃。 5.2温度计：量程1℃～55℃，分刻度0.1℃。 5.3培养箱：35℃~37℃和24℃~26℃。 5.4吸管：1mL、5mL和10mL，分刻度0.1mL。 5.5“L”型玻璃涂布棒：直径3mm~4mm，可涂布45mm~55mm的区域。 5.6接种环：3mm直径。 5.7 天平：量程2kg，灵敏度0.1g。 SN/T2552.13—2010 5.8 灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、开罐器。 5.9 样品稀释瓶：100mL、125mL、160mL、250mL和2L样品稀释瓶。 5.10 15mm×150mm灭菌平皿。 5.11 假单孢菌属标准质控菌株：铜绿假单孢菌，ATCC10145；荧光假单孢菌，ATCC13525。 6培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应为蒸馏水。 6.1CFC琼脂：见附录A第A.1章。 6.2营养琼脂（NA)：见附录A第A.2章。 6.3克氏双糖铁：见附录A第A.3章。 6.4氧化酶试剂：见附录A第A.4章。 6.5API20NE生化鉴定试剂盒或类似产品。 注：API20NE是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 7 假单孢菌属检验方法 7. 1 方法提要 乳及乳制品中假单孢菌是通过选择性分离、生化鉴定等方法对乳及乳制品中可能存在的假单孢菌 进行定性和定量的检验。 7.2检验程序 假单孢菌属检验程序见图1。 样品25g(25mL） 225mL灭菌生理盐水(DW) 90mL灭菌生理盐水(DW) 0.1mL接种CFC平板 25℃±1℃48h 挑选可疑菌落，接种营养琼脂平板 25 C±1℃ 24 h API20NE或其他生化鉴定系统 假单孢菌属认定试验 克氏双糖铁试验 氧化酶试验 菌体形态为杆状，动力阳性，在空气中生 长而厌氧条件下不生长，接触酶、氧化酶 阳性分解葡萄糖，O-F试验为氧化型 报告结果 图1假单孢菌属检验程序 SN/T 2552.132010 8检验步骤 8.1制备样品 取样按照SN/T2552.1执行。无菌称取样品25g（或mL）加人500mL样品稀释瓶中，加人 225mL灭菌盐水（1：10稀释），或者将样品直接称量到装有225mL灭菌生理盐水的样品稀释瓶中，振 摇使样品充分混匀，混合均匀后，取10mL悬浮液于90mL灭菌盐水（1：100稀释）进行稀释，必要时采 用相同方法进一步10倍稀释。其他乳制品在制样时按SN/T2552.2进行。 8.2接种样品 取两个CFC琼脂平板，分别移取初始悬液0.1mL用灭菌玻璃涂布棒涂布于该平板上，待表面干燥 后翻转平板于25℃土1℃培养48h。对系列10倍稀释液用同样方法操作。 8.3假单孢菌属的计数和菌落选择 培养48h后，对平板进行菌落计数，保留菌落在15个～300个范围的平板，从每块平板上随机选择 5个可疑菌落。从平板上挑取5个菌落划线接种于营养琼脂平板，25℃培养24h，选择菌落进行生化反 应确认试验。 8.4生化确认试验 8.4.1氧化酶试验 按附录A配方将试剂溶于蒸馏水中（用前配制），待溶解后，用该试剂将滤纸润湿，用塑料材质或铂 丝制成的接种针挑取菌落涂于滤纸条上在5s～10s内观察颜色反应，如果出现紫色即为阳性，反之为 阴性。商品化试剂按使用说明操作。 8.4.2克氏双糖铁试验 挑取进行氧化酶试验的相同菌落在斜面划线，并穿刺于克氏双糖铁底部，25℃培养24h。假单孢 菌属细菌为氧化酶阳性，且仅在克氏双糖铁试管斜面生长。 8.4.3其他鉴别试验 可进行符合假单孢菌属生物学特性的七项认定试验：菌体形态为杆状，动力阳性，在空气中生长而 厌氧条件下不生长，接触酶、氧化酶阳性，分解葡萄糖，O-F试验为氧化型。 也可应用API20NE生化鉴定试剂或其他相当生化鉴定系统进行鉴定。 9结果描述 9.1计算方法 鉴定之后，计算每块平板得到鉴定的假单孢菌属数量，按式(1)计算： 6 XC (1) 式中： a—每块平板的假单孢菌数； A一挑选的可疑菌落数（5个）； SN/T 2552.13-2010 可疑菌落中与标准一致的菌落数； 6 C- 平板上总菌数。 用式(2)计算样品中所含假单孢菌数： Za N= 2 V(n+0.1nz)d 式中： N 样品中所含假单孢菌数； -所有保留平板上经过鉴定的假单孢菌属数量之和； V 每块平板接种液体积，单位为毫升（mL）； 第1个稀释度保留平板的数量； n1 n2 第2个稀释度保留平板的数量； d 稀释倍数。 9.2 结果报告 经生化鉴定确认后，进行计算，报告每克（或毫升）样品中的假单孢菌属菌落数值，以CFU/g或 CFU/mL表示。 SN/T.2552.13—2010 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1CFC琼脂（十六烷三甲基溴化氨、梭链孢酸钠、头孢菌素Ⅱ琼脂） A.1.1 基础成分 明胶陈 16.0 g 10.0 g 酸水解酪蛋白 硫酸钾 10. 0 g 氯化镁 1. 4 g 琼脂 12.0g~18.0g(取决于胶的强度） 蒸馏水 1000mL A.1.2制法 将各成分加人蒸馏水中，加热并不断搅拌，煮沸1min，使琼脂溶解，分装适当的容器，121℃高压灭 菌15min，25℃下最终pH为7.2±0.2。 A.1.3抑制剂 十六烷三甲基溴化氨、梭链孢酸钠、头孢菌素Ⅱ琼脂各0.1g，分别溶解于100mL蒸馏水中，过滤 除菌。使用时按每100mL基础培养基（47℃下）加十六烷三甲基溴化氨1mL，梭链孢酸钠1mL，头孢 菌素Ⅱ琼脂5mL，混匀，倾注平板，用前在安全柜中半开盖子放置30min使表面干燥，制好的平板可在 0℃～5℃保存1个月。 A.2 营养琼脂(NA) A.2.1 成分 肉浸出粉 3. 0 g 蛋白陈 5. 0 g 5.0 g 氯化钠 琼脂 12.0g~18.0g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2制法 将各成分加人蒸馏水中，加热煮沸，使各成分完全溶解，于25℃下调节pH至7.0士0.2。121℃灭 菌20min备用。 A.3克氏双糖铁琼脂 A.3.1成分 牛肉浸粉 3. 0 g