中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR检测方法 Detection of Clostridium botulinum in foods by PCR 2010-03-02发布 2010-09-16实施 HO 中华 人民共和国 发布 数码防伪 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2525—2010 前 言 本标准参照美国FDABAM第17章第5部分：A、B、E、F型肉毒梭菌PCR检测方法[U.S.FDA， Bacteriological Analytical Manual Online,Chapter17(V),2001:Specific Detection of Clostridium botu- linumTypesA，B，EandFUsingthePolymeraseChainReaction(PCR).J经研究和验证后制定。 本标准的附录A、附录B均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈双雅、谢明星、张永祥、陈伟玲、王群力、刘棠、彭小莉、周赞虎、张孟璋。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2525—2010 食品中肉毒梭菌的PCR检测方法 1范围 本标准规定了食品中肉毒梭菌的PCR检测方法。 本标准适用于食品中A、B、E、F型肉毒梭菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.12食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验 GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。 3.1，术语和定义 3. 1. 1 肉毒梭菌Clostridiumbotulinum 肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一 类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。 3. 1. 2 聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR 模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计 的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶 的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸 这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。 3.2缩略语 3.2.1 bpbasepair 碱基对。 3. 2. 2 DNAdeoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸。 3.2.3 dNTPdeoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核苷三磷酸。 SN/T2525—2010 3.2. 4 dATPdeoxyadenosine triphosphate 脱氧腺苷三磷酸。 3.2.5 dCTPdeoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸。 3. 2. 6 dGTPdeoxyguanosinetriphosphate 脱氧鸟苷三磷酸。 3.2.7 dTTPdeoxythymidine triphosphate 脱氧胸苷三磷酸。 3.2. 8 Taq Thermus aquaticu 水生栖热菌。 3. 2. 9 Tristris (hydroxymethyl)aminomethane 三(羟甲基)氨基甲烷。 3. 2. 10 EDTAethylenediaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸。 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心 处置，并按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行 6方法提要 样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到TPGY培养，对培养物采用热裂解抽提DNA 法，或商品化细菌基因组DNA提取试剂盒抽提DNA法制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电 泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。 设备和材料 7 7.1天 天平：感量0.001g。 7.2 生物安全柜。 7.3 厌氧培养装置。 7.4 恒温培养箱：35℃±1℃和28℃士1℃。 7.5 高压灭菌锅。 7.6 恒温水浴，37℃±1℃和60℃士1℃。 2 SN/T2525—2010 7.7高速台式冷冻离心机：14000g。 7.8冰箱：-20℃和-70℃。 7.9PCR仪。 7.10电泳仪。 7. 11 凝胶成像分析系统。 7. 12 紫外分光光度计。 7. 13 微量可调移液器：0.2μL2μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 7.14 离心管：1.5mL。 7. 15 PCR反应管：200μL~500uL 8培养基和试剂 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水应符合GB/T6682中一级水的规格。 8.1肉培养基：见附录第A.1章。 8.2胰蛋白陈葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGX).见附录第A.2章。 8.3厌氧卵黄琼脂：见附录第A.3章 8.4无水乙醇和95%乙醇。 8.5PBS缓冲液：氯化钠7.650/L、磷酸氢二钠0.724g/L、磷酸二氢钾0.210g/L(pH7.4)。 8.6 TE缓冲液：10mmol/LTrisHCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。 8.7 蛋白酶K溶液：用TE配制，使用浓度为10mg/ml 8.8溶菌酶溶液：用TE配制，使用浓度为10tmg/mL 8.93mol/L乙酸钠溶液（pH5.25。 8.1020%SDS溶液。 引物：根据附录B中表B/1的序列合成物，加超纯水配制成1poμmol/L储液，用于PCR测试 8.11 的引物浓度为10μmol/L。 8.12 TaqDNA聚合酶。 8.13 dNTP:dATP、dTTPdCTP、dGTP。 8.14 琼脂糖：电泳级。 8.15 漠化乙锭。 8.16 DNA分子量标准。 8.17 阳性对照：含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA。 8.18 商品化细菌基因组DNA提取试剂盒。 8.1910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)、200mmol/L氯化钾、15mmol/L氯化镁。 1000mL，使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。 8.216X加样缓冲液：30mmol/LEDTA，36%（体积分数）甘油，0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝FF， 0.05%（质量浓度）溴酚蓝。 9检验程序 检验程序见图1。 3 SN/T2525—2010 样品 疤肉培养基和TPGY增菌 厌氧卵黄琼脂分离纯培养物 可疑菌落TPGY培养 模板DNA的制备 1 PCR扩增 阴性 阳性 确证实验 报告 图1肉毒梭菌PCR检测程序 10检验步骤 10.1样品制备和增菌培养 接种前，先将增菌培养基煮沸10min～15min，以排除溶解于培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇 动。每15mL增菌肉汤中接种1g～2g固体食品或1mL～2mL液体食品，接种时将接种物慢慢接人 肉汤液面以下。每份样品接种两管疱肉培养基，置35℃土1℃，同时接种两管TPGY培养基，置28℃土士 1℃，厌氧培养5d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按10.2分离纯培 养物。若未见生长，则继续培养10d。 10.2分离纯培养物 取1mL～2mL培养液置于螺旋帽试管中，加人等量过滤除菌的无水乙醇。混匀，在室温下放置 1h。或80℃加热10min～15min以破坏其繁殖体。 用接种环取1环～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下 35℃士1℃培养48h。 挑取约10个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不 规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延 伸，继而菌落产生不规则外形。 接种可疑菌落到TPGY培养基中，置35℃士1℃厌氧培养24h。 10.3模板DNA的制备 以下两种方法任选一种进行。剩余培养液置4℃保存，以备确证试验使用。 10.3.1热裂解抽提DNA法 取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中，14000g离心2min，弃去上清液。加人1.0mL PBS悬浮菌体沉淀，14000g离心2min，去上清。用400μLPBS重悬沉淀，加人10mg/mL溶菌酶溶 液100μL，37℃士1℃水浴15min，期间每5min～7min颠倒混匀离心管。加人10mg/mL蛋白酶K 溶液10μL，60℃±1℃水浴1h，期间每10min～15min颠倒混匀离心管。沸水浴10min，14000g离 心2min，上清液转移至新的灭菌小离心管中。加入3mol/LNaAc溶液50μL和95%乙醇1.0mL，颠 4 SN/T2525—2010 倒混匀，一70℃或一20℃放置30min，14000g离心10m