SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1698—2010 代替SN/T1698-2006 伪狂犬病检疫规范 Quarantine protocol for Aujeszky's disease 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1698—2010 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替了SN/T1698一2006《猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程》。 本标准与SN/T1698一2006相比，主要技术变化如下： 本标准中第4章引用了GB/T18641一2002《伪狂犬病诊断技术》中第3章的内容； 修改采用了GB/T18641一2002《伪狂犬病诊断技术》中第2、4、7章的内容； -本标准中第7章代替了《猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程》（SN/T1698一2006）。 本标准修改采用0IE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》(2008)中第2.1.2章制定，修改了病毒分离， PCR、血清中和试验的操作规程，增加了兔体接种试验、鉴别诊断ELISA方法、乳胶凝集试验、免疫荧光 试验的操作规程。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吕建强、卢体康、花群义、林志雄、张常印、姜焱、秦智锋、曹琛福、张彩虹、陶虹、 阮周曦、田纯见。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1698—2006。 建筑321---标准查询下载网 www.jz321.net SN/T1698—2010 伪狂犬病检疫规范 1范围 本标准规定了伪狂犬病的病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、兔体接种试验、血清中和试验、酶联免疫 吸附试验、乳胶凝集试验及免疫荧光试验的检疫技术规范。 本标准适用于进出境猪、羊、牛、犬、猫及其他易感动物伪狂犬病的检疫和诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18641一2002伪狂犬病诊断技术 3病毒分离鉴定 3.1试验材料及设备 DMEM培养液、细胞生长液、细胞维持液配方见附录A，猪肾细胞系细胞（PK-15)或仓鼠肾细胞 (BHK21）、新生特牛血清、青霉素、链霉素、0.22μm微孔滤膜、细胞培养瓶、37℃恒温培养箱等。 3.2操作方法 3.2.1样品采集 用于病毒分离的样品可以是活猪的口咽液、鼻液（拭子)或扁桃体活组织，或来源于死亡猪或表现临 床症状猪的样本，其中脑和扁桃体样本是首选。对于潜伏感染的猪，三叉神经节是分离病毒最合适的 部位。 牛感染该病的特征通常是播痒，可以采集脊索的相应部位作为样本。 3.2.2样品处理 在含抗生素（例如200IU/ml.青霉素和100μg/mL链素）的细胞培养液或常规缓冲液中对以上 样品进行匀浆处理，样品与液体的比例为1：5，反复冻融3次后3000r/min低速离心10min获得上 清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，然后利用其接种任何对伪狂犬病毒敏感的细胞培养系统。如果不立 即接种细胞分离病毒，可以将其置于一70℃保存作为接种材料。 3.2.3接种细胞 分离该病毒常使用猪肾细胞系（PK-15），接种前采用细胞生长液培养细胞，接种后使用的细胞维持 液应该含有抗生素，例如200IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。 将样品滤液接种到已长成单层的PK-15细胞上，接种量为最终培养维持液的10%，37℃恒温培养 箱中吸附1h，然后加人DMEM培养维持液，置于37℃恒温培养箱中培养，逐日观察。 1 SN/T1698—2010 3.3观察结果 通常伪狂犬病毒诱导产生的细胞病变效应(CPE)出现在接种后的24h～72h内，因此用于接种的 细胞培养物应维持5d~6d。 当接种样品滤液后出现CPE时，表现为细胞变圆、聚集，成网状、细胞层脱落，有时形成合胞体。在 没有明显CPE时，应盲传三代，如仍然无CPE出现，则伪狂犬病毒分离检测为阴性。 3.4病毒鉴定 对于出现CPE的细胞培养物进行病毒鉴定，可以采用病毒中和试验、免疫荧光试验或聚合酶链式 反应，出现阳性结果即可判定为伪狂犬病毒分离鉴定阻性 4聚合酶链式反应(PCR） 按照GB/T18641一2002中的操作方法进行 5免体接种试验 5.1试验动物 为伪狂犬病抗体阴性。 5.2样品处理 无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用 灭菌生理盐水配成1：5乳悬液反复冻融3次后，以3000z/min离心10min，取上清液加人青霖素和 链素溶液，授终浓度分别为280IU/mL和100μg/ngL,置4℃冰箱中作用12 h,作为待检样品。 5.3接种试验动物 将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家免接种1ml～2mL。 5.4结果观察及判定 5.4.1伪狂犬病霉感染阳性 被接种动物在接种后24h～48h注射部位出现奇痒，家免兔哨咬注射局部，导致皮肤溃烂，家免尖 叫、口吐白沫，最终死亡。 5.4.2伪狂犬病毒感染阴性 观察5d后，接种家免仍健活且无奇痒症状，判为阴性。 6血清中和试验 6.1试验材料及设备 细胞：选用对伪狂犬病毒敏感的细胞，例如PK-15细胞系或原代肾细胞。 细胞培养液：根据细胞种类不同选用不同培养液，例如PK-15细胞的培养液可以是加10%胎牛血 2 建筑321---标准查询下载网www.jz321.net SN/T1698—2010 清的DMEM培养液。 标准伪狂犬病病毒株，适宜保存于一70℃或更低的温度，或冻干保存于4℃。 标准阳性血清和标准阴性血清。 37℃二氧化碳培养箱等。 6.2预备试验 利用Reed&Muench法或Karber法测定病毒的TCIDso（50%tissuecultureinfectivedose），参见 附录B。 6.3正式试验 6.3.1定性试验 6.3.1.1将样品血清置于56℃水浴.30min，破坏血清中的补体。 6.3.1.2将未稀释的血清加人到96孔细胞培养板中，每份3孔每孔50μL。 6.3.1.3每孔加入50μL含有100TCIDso/50μL(或2000TCIDso/mL)的伪狂犬病囊液，振荡后置于 37℃二氧化碳培养箱中1h。 6.3.1.4每孔加人150μL细胞悬液，细胞浓度约为1.5×105细胞/mL，轻微振荡使细胞均勾分布在 孔的底部，然后置于37℃二氧化碳培养箱中（或密封细胞板后置于37℃恒温培养箱中）。 6.3.1.5每次检测应设置如下对照： 度的病毒液设8孔重复，每孔加50μL，在加大50*pL培养液后置于37℃二氧化碳培养箱中 1h，以6.3.1.4的方式加人细胞悬液后培养； b）细胞对照：至少作2孔重复，每孔加100μL培养液及150L浓度约为150000细胞/mL的细 胞悬液； 阳性血清对照：使用知伪狂厌病毒中和抗体滴度（T)的血清，作4T、2T、T、T/2、T/4五个稀 释度，每个稀释度至尘作2扎重复，海孔50luL，以63.1.36.3.1.4的方式分别加人病毒忍 液、细胞悬液后培养； 阴性血清对照：以6.3,1.2、6.3.1.3、6.3.1.4的方式操作 d) 被检血清对照：为了验证待检血清是否有细胞避性作用而设立此对照，每份待检血清50μL， e) 加入50μL培养液后置手37℃二氧化碳培养箱中1h，然后以6.3.1.4的方式加人细胞悬液 后培养。 6.3.1.6在试验后48h和72h，分别利用倒置显微镜（100×）观察96孔细胞培养板，检查细胞孔中是 否有毒性反应和CPE，只有如下对照结果成立才能判定待检样品的试验结果： a) 病毒对照：病毒悬液的滴度应该在30TCIDs/50μL～300TCID5o/50μL之间； b）细胞对照；细胞对照孔的细胞正常、无变化； 阳性血清对照：测得的血清抗体滴度应与预期滴度相当（波动在1个滴度范围之内）； c) d) 阴性血清对照：没有CPE出现； 被检血清对照：被检血清的CPE检查应考患其对细胞毒性作用的可能。 6.3.1.7待检血清的检测会出现如下结果： a） 在3d内，3孔均出现CPE的，判为阴性； b）在第3天，3孔均未出现CPE的，判为阳性； c) 在第3天，3孔中只有1孔出现CPE的，判为可疑，需要重新检测； 3 SN/T1698-2010 d）在第3天，出现CPE的小斑时，判为可疑，需要重新检测； e）在待检血清对照孔及测试孔有细胞毒性效应的，判为可疑，箫要重新检测。 注：在试验后16h替换新鲜培养液将降低细胞毒性效应，同时不影响特异性抗体的滴度。 6.3.2定量试验 6.3.2.1* 将样品血清置于56℃水浴30min，破坏血清中的补体。 系列倍比稀释，每个稀释度作3孔重复，在最后一个稀释孔中混匀后弃去50ul。 （或2000TCIDso/mL）的伪狂犬病毒液。随后的操作参照6.3.1.3、6.3.1.4。 6.3.2.4检测对照设置同6.3.1.5。 6.3.2.5结果判读是在试验后48h和72h，分别利用倒置显微镜（100×）观察96孔细胞培养板，检查 细胞孔中是否有毒性反应和CPE，计算血清抗体效价。 血清抗体效价≥1：2，判为伪狂犬病中和抗体阳性。 血清抗体效价大于1：1而小于1：2，判为可疑，应采用ELISA或乳胶凝集试验验证结果，或者重 新采样检测，间隔期至少8d。 血清抗体效