SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1151.1—2011 代替SN/T1151.1—2002 虾桃拉综合征检疫技术规范 Quarantine protocol for shrimp taura syndrome 2011-05-31发布 2011-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1151.1—2011 前言 SN/T1151系列标准共分为六部分： 虾桃拉综合征检疫技术规范； 对虾白斑病检疫技术规范； 一斑节对虾杆状病毒（MBV)诊断方法； —一虾黄头病检疫技术规范； 一对虾杆状病毒(BP)检验方法； 一对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。 本部分为SN/T1151的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1151.1一2002《对虾Taura综合征病毒（TSV）逆转录聚合酶链式反应（RT PCR)诊断方法》。本部分与SN/T1151.1一2002相比，主要技术内容变化如下： 整合和优化RT-PCR检测方法； 新增Real-timeRT-PCR检测方法。 本部分修改采用世界动物卫生组织（OIE)的《水生动物疾病诊断手册》（2009版）第2.2.4章，并对 虾桃拉综合征RT-PCR检测方法进行了整合和优化 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：熊炜、张强、刘、郑腾、蒋静、李健、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1151.1—2002。 1 SN/T1151.1—2011 虾桃拉综合征检疫技术规范 1范围 本部分适用于虾桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 3概述 桃拉综合征（Taurasyndrome）是一种由桃拉综合征病毒（Taurasyndromevirus，TSV）感染而引起 的严重威胁虾养殖的重要疫病，它是世界动物卫生组织（OIE)规定的需上报的水生动物疫病。TSV几 的虾苗，其致死率高。TSV感染有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期，虾表皮上皮 的组织切片中可以看到典型的病理损伤。而在过渡期和慢性期，却没有典型的病理损伤；虾发病死亡主 要发生在急性期，急性感染后的幸存者在经过短暂的过渡期后，进入长时间的慢性感染期，处于慢性感 染期的虾的淋巴器官终生持续有病毒存在，这些携带有病毒的虾可把病毒水平传播给其他易感虾。病 毒学研究证实，TSV是一种小的正二十面体无包膜病毒，直径32nm，其基因组为单正链RNA由10205 个核苷酸组成，含有两个大的开放阅读框（Openreadframe，ORF），ORF1编码非结构蛋白如解旋酶、 蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶等，ORF2编码结构蛋白如衣壳蛋白VP1、VP2、VP3（其分子量大 小分别为55kDa、40kDa、24kDa）。 4试剂和材料 4.1Tag酶及10倍Taq酶浓缩缓冲液：Tag酶浓度为5U/μuL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.2逆转录酶及10倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为50U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.3RNA酶抑制剂：浓度为40U/μL，一20℃保存，避免反复冻融 4.4dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。 4.5RT-PCR引物：引物浓度均为20umol/L；引物有两对，可任选其一使用；引物9992F和9195R为 OIE推荐引物，其扩增基因片段的大小为231bp，引物TSVF和TSVR扩增的基因片段大小为295bp， 其序列如下： 上游引物（9992F）：5'-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3" 下游引物（9195R）：5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3 上游引物（TSVF):5"-ATT-GAA-TAC-TTA-GCA-CAG-CGA-CC-3" 下游引物（TSVR):5'-GAA-CAC-CAC-TAC-CAT-AGG-GGA-G-3" 1 SN/T1151.1—2011 4.6Real-timeRT-PCR引物和探针：引物TSV1004F、TSV1075R和探针TSV-P1为OIE推荐引物和 探针，引物浓度为15μmol/L，探针浓度为5μmol/L，其序列如下： 上游引物（TSV1004F）：5-TTG-GGC-ACC-AAA-CGA-CAT-T-3" 下游引物（TSV1075R):5'-GGG-AGC-TTA-AAC-TGG-ACA-CAC-TGT-3" TaqMan探针（TSV-P1)：5-CAG-CAC-TGA-CGC-ACA-ATA-TTC-GAG-CAT-C-3'，其5'端和 3'端分别标记FAM和TAMRA。 4.7随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50μmo1/L，一20℃保存。 4.8DNA相对分子质量标准：适合检测分子量大小50bp～500bp间的DNA片段，一20℃保存。 4.910倍电泳上样缓冲液：4℃保存。 4.10DEPC水：自配（见A.1)或购买商品化试剂。 4.11 EB溶液：4℃保存（见A.2）。 4.12Trizol试剂：4℃保存。 4. 13 3三氯甲烷：常温保存。 4.14异丙醇：使用前预冷至一20℃。 4.1575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。 5仪器与设备 5.1PCR仪：ABI9700或相同性能PCR仪。 5.2荧光PCR检测仪：ABI7700、ABI7500或相同性能荧光PCR检测仪。 5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达13000g以上。 6临床症状的诊断 虾桃拉综合征的病程有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期和过渡期，虾表现出 独特的外部症状，可据此对该疾病作出初步诊断。 在急性期和过渡期，濒死虾体表出现大量的红色色素体，使感染虾全身呈暗淡的红色，而尾扇和游 泳足呈明显的红色，用10倍放大镜观察细小附肢（如末端尾肢或腹肢）的表皮上皮，可以看到病灶处的 在过渡期及后期，受感染虾可出现多处随机、不规则、黑色沉着的表皮病灶，这些黑色沉着的斑点是 由血细胞累积而成的，该阶段虾可能不会出现表皮变软及红色素扩散，行为和摄食可能会保持正常。成 功蜕皮后，病虾从过渡期发展到慢性期。 在慢性期，虾几乎没有明显的体症，行为和摄食正常，但病毒在淋巴器官中保持持续感染，可能会终 生带毒，可把病毒水平传播给其他易感虾。处于慢性期的虾对正常环境刺激的抵抗力要低于未被感染 的虾（如：盐度突然降低）。 7采样和样品前处理 7.1采样 出境检疫采样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池)进行，采样数量 根据GB/T18088确定。采集送实验室检测的样品可以为稚虾、半成虾和成虾。采集的样品应保持鲜 活，0℃～4℃冷藏保存。 2 SN/T 1151.1—2011 7.2样品前处理 7.2.1随机取5只～10只新鲜的成虾作为取样标本，采集的部位包括：虾头部的鳃丝、肝胰腺、淋巴器 官或血淋巴等组织（可部分或全部采集这些组织）。对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作为样品。 7.2.2取鳃丝时，用灭菌过的剪刀去除头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。 7.2.3取肝胰腺时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，露 出内部的组织器官，其中深褐色的组织为肝胰腺，用剪刀剪取整块肝胰腺组织。 7.2.4取淋巴器官时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉， 暴露出内部的组织器官，在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出白色、呈二裂片状的淋巴器官。 7.2.5取血淋巴时，先用1mL医用注射器吸取500μL柠檬酸盐溶液（见A.3），然后使虾腹部朝上，将 针头水平插入正数第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处，然后缓慢吸取血 淋巴。 7.2.6将采集的样品，按每克样品加入1mLTN缓冲液（见A.4），然后用玻璃勾浆器将样品匀浆。将 匀浆液转移至1.5mL离心管中，4℃、2000g离心5min，吸取上清液备用。 7.3阳性对照样品和阴性对照样品的处理 品分装后于一70℃超低温冰箱保存备用。实验前将冷冻组织样品取出，然后按7.2.6进行样品前 处理。 RNA抽提及cDNA模板制备 81 8.1RNA抽提 分别取100μL待检样品勾浆上清液，以及TSV阳性样品和阴性样品的上清液，加人1mLTrizol 试剂，用枪头充分吹打20次～30次；加人200uL三氯甲烷，涡旋振荡30s，混匀；13000g离心15min； 取上层水相，加500μL异丙醇，上下颠倒数次混匀，一20℃放置20min；13000g离心10min；弃上清 液，沉淀用1mLDEPC水配制的75%乙醇清洗；8000g离心10min；弃上清液，沉淀室温干燥10min； 加3OμLDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液应尽快用于逆转录合成cDNA模板。商品化RNA提取 试剂盒同样适用于本标准的RNA抽提。 8.2cDNA模板制备 取18.5μLRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP1μL、随