SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 0177—2011 代替SN0177—1992 出口食品中产气荚膜梭状 芽孢杆菌计数方法 Method for enumeration of clostridium perfringens in food for export 2011-09-09 发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 0177—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替SN0177一1992《出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法》。 本标准与SN0177一1992相比，主要技术变化如下： 变更为推荐性标准； 一检测方法部分参考了ISO7937：2004《食品和动物饲料微生物 产气荚膜梭状芽抱杆菌计 数菌落计数技术》内容，在标准中增加乳糖-亚硫酸盐试验作为确证试验，减除了含卵黄的 TSC琼脂和PY培养基的使用； 补充了商品化的全自动微生物鉴定仪。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、谢小珏、王赢、陈立 SN/T 0177—2011 出口食品中产气荚膜梭状 芽孢杆菌计数方法 1范围 本标准规定了出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridiumperfringens）的计数检验方法。 本标准适用于出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 产气英膜梭状芽孢杆菌clostridiumperfringens 在特定的选择性培养基上，细菌菌落生长呈现黑色特点（亚硫酸盐降解为硫化物而形成黑色沉淀 物，并使菌落呈现黑色），分解乳糖产酸产气，48h内能液化明胶的细菌。 4设备和材料 4.1无菌吸管：1.0mL和10.0mL，分刻度分别为0.1mL和1.0mL。 4.2无菌培养皿：直径90mm。 4.3均质器及均质袋（或均质杯）。 4.4恒温培养箱或厌氧培养箱：37℃土0.5℃。 4.5恒温水浴锅：46℃土0.5℃。 4.6厌氧发生装置。 4.7放大镜和（或)菌落计数器。 4.8光学显微镜10×～100×。 4.9冰箱:2℃~8℃。 4.10天平：感量0.1g。 4.11全自动微生物鉴定系统VITEKcompactl。 1）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 SN/T 0177—2011 5培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的分析实验室用水。 5.1亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC):见A.1。 5.2液体硫乙醇酸盐培养基：见A.2。 5.3乳糖亚硫酸盐培养基（LS)：见A.3。 5.4缓冲动力-硝酸盐培养基：见A.4。 5.5亚硝酸盐检测试剂：见A.5。 5.6锌粉。 5.7乳糖-明胶培养基：见A.6。 5.8蛋白陈水：见A.7。 VITEK2ANI生化鉴定卡2）。 6 检验程序 产气荚膜梭状芽孢杆菌检验程序见图1。 检样 25g（或25mL）样品+225mL稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2个到3个适宜连续稀释度的样品匀液，取1mL接种SC琼脂 计数黑色菌落 动力-硝酸盐试验 LS培养基 VITEK compact 乳糖一明胶试验 计算产气英膜梭状芽孢杆菌数 报告 图1产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验程序 2） 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 2 SN/T 0177—2011 7操作步骤 7.1样品的稀释 7.1.1无菌操作称取检样25g（mL）放人无菌均质器或均质袋中，加人225mL蛋白陈水，均质，制 成1：10样品匀液。 7.1.2吸取1：10样品匀液1mL，加人到9mL蛋白陈水中，混合均匀，制成1：100样品匀液。必要 时，按此法将样品作进一步的10倍递增稀释。 7.2接种与培养 品匀液加人到两个无菌平皿内。 7.2.2将10mL～15mL维持在44℃～47℃的SC琼脂倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。待培养 基凝固后，再覆盖上10mLSC琼脂，待其完全凝固。 7.2.3翻转平板，放人厌氧罐或其他适宜容器中，厌氧环境下37℃士0.5℃下培养20h士2h。培养 时间过长可能会导致平板颜色过黑。 7.3平板计数 7.3.1选取菌落数<150CFU的平板，计数每个平板上的黑色菌落数，记录稀释倍数。 7.3.2每个平板挑取5个典型或可疑菌落（小于5个时应全部挑选）进行确证。 7.4乳糖-亚硫酸盐试验确证 7.4.1接种 将SC琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧环境下37℃士0.5℃下培 养18h24h。以无菌吸管移取硫乙醇酸盐培养物5滴加入到乳糖-亚硫酸盐（LS)培养基中。46℃水 浴中需氧条件下培养18h～24h。 7.4.2观察 观察倒管内有否气泡产生及试管底部是否变黑（亚硫酸铁沉淀），若倒管中四分之一以上充满气体 并且有黑色沉淀物则可判定为阳性。当倒管中产生的气体不足四分之一时，立即以无菌吸管从先前的 LS培养基中吸取5滴加到另一LS培养基试管中，46℃水浴培养18h～24h，再次观察结果。 7.4.3判读 在SC培养基中形成黑色菌落，同时LS培养基中反应阳性的细菌，可确认为产气荚膜梭状芽孢杆 菌，除此之外应视为阴性。 7.5动力-硝酸盐试验和乳糖-明胶液化试验确证 7.5.1纯化 将SC琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧条件下37℃土0.5℃培养 0.5℃培养18h～24h，获得纯培养菌落。如有必要，可重复上述步骤，以获得完全分离的，典型的黑色 菌落。 3 SN/T 0177—2011 7.5.2接种 将挑取的纯菌落分别穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基，厌氧条件下37℃土 0.5℃培养24h。 7.5.3动力-硝酸盐试验观察 在透射光下检查缓冲动力-硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺线生长情况，有动力的菌株沿着穿刺线 呈扩散生长；没有动力的菌株，仅沿穿刺线生长。分别加0.5mL试剂甲与0.2mL试剂乙于缓冲动力 硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。出现橙红色者，表明有菌株将硝酸盐还原成了亚硝酸盐。若 15min内未出现颜色变化，则添加少许金属锌粉，放置10min。如果加锌粉后出现橙红色，表明菌株不 能还原硝酸盐。若出现微弱的亚硝酸盐反应（如：浅粉色）则应排除，因为产气荚膜梭状芽孢杆菌的反应 比较剧烈而且迅猛。 7.5.4乳糖-明胶试验观察 发现产气和培养基变黄色，表明乳糖发酵并产酸。将试管置5℃冷却1h，检查明胶液化情况。若 培养基仍为固态，则需37℃土0.5℃再培养24h，再次检查明胶是否液化。 7.5.5判读 在SC琼脂上形成黑色菌落，无动力的，通常会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，分解乳糖产酸产气，48h 内能液化明胶的细菌，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。 7.6自动微生物鉴定系统确证 如选择VITEKcompact，可从SC平板上挑选可疑菌落，用生理盐水制成浊度适当的菌悬液，使用 VITEKcompact全自动微生物鉴定系统进行鉴定。 7.7判定 任何符合7.4.3或者7.5.5的判读确证或者经7.6的鉴定为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落，确认 为产气荚膜梭状芽孢杆菌。 8结果报告 样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数，基于被证实为产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落的百分数。 例如：10-4稀释的平板中，平均有85个菌落，由2个平板上选取的10个菌落中，有8个被证实为产 气荚膜梭菌，那么每克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数，即为85×（8/10）X10000=680000CFU。 根据计算结果报告检样中产气荚膜梭状芽孢杆菌数/g（mL）。 4 SN/T 0177—2011 附录A （规范性附录） 培养基和试剂3 A.1亚硫酸盐-环丝氨酸(SC)琼脂 A.1.1基础培养基 15.0 g 胰蛋白 酵母膏 5.0 g 5.0 g 大豆陈 1.0 g 焦亚硫酸钠（Na2SzO） 1.0g 柠檬酸铁铵 琼脂 9.0 g~18.0 g A.1.2D-环丝氨酸溶液 溶解4gD-环丝氨酸于100mL水中，过滤除菌。存放于3℃士2℃，4周内用完。 A.1.3制备 将基础培养基各成分加热溶解在1000mL水中，调节pH使灭菌后室温下pH7.6士0.2，分装到适 宜容量的烧瓶中，121℃高压灭菌15min。倒平血前，将100mL基础培养基冷却到44℃～47℃，加过 滤除菌的D-环丝氨酸溶液1mL。 当SC琼脂培养基平板被用来作纯化菌落时（动力-硝酸盐试验和乳糖-明胶试验）时，可直接取 15mL冷却到44℃～47℃的基础培养基倾注平板 存放于5℃±3℃，可保存2星期。 A.2硫乙醇酸盐液体培养基 15.0 g 胰酪陈 0.5 g L-胱氨酸 5.5 g D-葡萄糖 酵母膏 5.0 g 氯化钠 2.5 g 0.5 g 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸） 刃天青 0.00