SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1151.3—2013 代替SN/T1151.3-2002 斑节对虾杆状病毒病（MBV） 检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with Penaeus monodon-type baculovirus 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1151.3—2013 前言 SN/T1151共分为6部分： 第1部分：虾桃拉综合征检疫技术规范； 第2部分：对虾白斑病检疫技术规范； 第3部分：斑节对虾杆状病毒病（MBV)检疫技术规范； 一第4部分：虾黄头病检疫技术规范； 一第5部分：对虾杆状病毒（BP)检验方法； 一第6部分：对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。 本部分为SN/T1151的第3部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1151.3-2002《斑节对虾杆状病毒诊断方法》。 本部分与SN/T1151.3一2002相比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 增加了湿片法； 一细化了组织切片技术； -PCR方法中的引物变为更为敏感的两对嵌套式引物。 本部分参考了OIE水生动物诊断手册2006版第2.3.5章中推荐的斑节对虾杆状病毒的湿片法、 组织切片法和PCR检测方法。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：高隆英、兰文升、景宏丽、冯东岳、王红英、江育林。 本部分所代替标准的历次版本发布情况： -SN/T1151.3-2002。 SN/T 1151.32013 斑节对虾杆状病毒病（MBV） 检疫技术规范 1 范围 SN/T1151的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病（Penaeusmonodon-typebaculovirus，MBV)的检 测方法，对粪便的湿片检测可针对亲虾的初筛检测。组织切片和PCR方法结合可作为确诊的检疫 方法。 本部分适用于斑节对虾杆状病毒病的诊断和鉴定，适用于该病的流行病学调查、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MBV：斑节对虾杆状病毒（Penaeusmonodon-typebaculovirus） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl)aminomethane) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Davison'sAFA：戴维斯固定液 仪器和设备 4. 1 石蜡组织切片机。 4. 2 组织脱水机（使用手工脱水的缸）。 4. 3 石蜡包埋机。 4.4切片染色机（使用手工染色所需的缸）。 4.5展片所用水浴锅。 烘片机。 4.7 正置显微镜。 4.8 载玻片，盖玻片等常规组织切片用具。 4.9 冷冻离心机。 4.10 一80℃超低温冰箱。 1 SN/T1151.3—2013 -20℃普通冰箱。 4.11 4.12PCR仪。 4.13微量移液器及吸头。 4.14电泳仪。 4.15 凝胶成像仪或紫外透射仪。 5试剂和材料 所用试剂除特殊规定外均为分析纯。 5.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格 5.2Davisons固定液（见附录A的A.1)。 5.3 石蜡（熔点52℃~54℃）：切片级。 5. 4 无水乙醇。 5.5 二甲苯。 5. 6 盐酸。 5.7 氢氧化钠。 5. 8 苏木素染色液（见A.2)。 5. 9 伊红染色液（见A.3）。 5.10 黏片剂（见A.4)。 5.11 蛋白酶K。 5.12 饱和酚。 5.13 三氯甲烷。 5. 14 Taq酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化 5.15引物： MBV1.4F5'-CGA-TTQ-CAT-ATC-GGC-CGA-ATA-3 MBV1.4R5'-TTG-GCA-TGC-ACT-CCC-TGA-GAT-3'扩增MBV核酸中的533bp片段。 MBV1. 4NF5'-TCC-AATfCGC-GTC-TGC-GAT-ACT-3 片段。 5.16DNAMarker2000。 5.17 琼脂糖。 6 诊断方法 6.1MBV湿片法 6.1.1制片 取整只幼体、仔虾头胸部或稚虾、成虾的肝胰腺，压片或涂片；或者收集大的稚虾到成虾的类便.用 干净的塑料虹吸管吸取粪便，放在玻璃离心管中收集，小心压片，做成湿片。可直接用相差或亮视野显 微镜镜检。 6.1.2在相差或亮视野显微下的结果观察 受MBV感染的肝胰腺或中肠细胞核肿大，在相差下核内可看到单个或多个折射率高的球形包涵 2 SN/T 1151.32013 体，单个包涵体直径从0.1um～20uμm。粪便湿片在亮视野显微镜下可观察到带折光性的近似球形的 包涵体。大小接近20μm。在新鲜粪便中，MBV包涵体常成团聚集，被核模所包裹。 6.2MBV组织病理切片 6.2.1组织固定 用Davison'sAFA固定欲检查的虾，准备足够的固定液，固定液体积应是欲固定的组织块总体积 的10～15倍，一般固定组织块大小不超过0.5cm3。 固定方法如下： a）对虾幼体或仔虾，用纱布、细网筛或者吸管把所选的幼体或仔虾直接放人固定液。固定12h～ 24h以上，然后转人70%的乙醇中保存。 b）稍大的仔虾和很小的稚虾：用针或尖头镊子切去体表虾壳，把虾直接浸泡在固定液中，固定 12h～24h以上，然后转人70%的乙醇中保存。 更大的仔虾、稚虾和成虾，用注射器往虾头处注入固定液（用量为样品体积的5%～10%。针 头大小根据虾的大小决定）。在肝胰腺处至少注射2个位点，然后取出肝胰腺浸泡在固定液 中，取出的肝胰腺进行适量分割、以不大于0.5cm²为宜，固定12h～24h以上，然后转人 70%的乙醇中保存。 6.2.2 组织学标本的修整取材 从70%的乙醇保存液中取出固定好的标本，置于木头或塑料垫板上，根据标本的大小进行修整，确 保目标组织能被有效切片。 a）幼体和仔虾：用擦镜纸将个体包好，放于脱永盒中进行脱水，包埋时去除擦镜纸，用热镊子调整 标本在包埋器血中的位置进行包埋。 b) 体长小于3cm的幼虾：切去体表虾壳，用单面刀片或解剖刀沿幼虾的中线右侧将标本纵剖两 半。取包含中线的左侧进行脱水，包埋时纵切面向下包埋。 体长大于3cm的幼虾或亚成年虾：用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断，再 将头胸沿中线右侧纵两半。取包含中线的左侧，切去步足80%的长度，剔除胃内容物；如果 头胸长度大于1cm，切取肝胰腺部分；取出的肝胰腺进行适量分割，以不大于0.5cm3为宜， 放人脱水盒中进行脱水，包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下包埋。 d）体长大于8cm的虾，参照大于3cm的虾进行修整，按照长宽不超过1cm×1cm、厚度不超过 0.5cm的要求，针对目标组织进行修整。 6.2.3组织脱水 用梯度乙醇逐步脱水。流程如下：70%乙醇（2h）-→80%乙醇（2h）→+90%乙醇（1.5h）→95%乙醇 （45min）-→95%乙醇（45min）→100%乙醇（30min）→+100%乙醇（30min）。 6.2.4组织透明 6.2.5浸蜡与包埋 将透明好的材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸溃1h～2h，再先后移人2个熔化的 石蜡液中浸渍3h左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后 的组织材料块放在装有蜡液的容器中，待蜡液表层凝固即迅速放人冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡 3 SN/T 1151.3-2013 块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。通常石蜡采用熔点为52℃～54℃.也可根 据季节及操作环境温度来选用。 6.2.6切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在 轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切成4um～6um厚的切片，对每个石 蜡包埋块至少切取两块不连续的切片。 6.2.7展片 在40℃的水浴锅中展片，用涂有黏片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 6.2.8切片脱蜡及H-E染色 室温低于25℃时，应将贴有切片的载玻片置于30℃～40℃的干燥箱内加温后.再尽快转人二甲 苯中脱蜡；或者将二甲苯稍加温而脱蜡，两法均可使切片脱蜡彻底。脱蜡后，人无水乙醇洗去二甲苯成 分，为防止脱片，再按以下步骤进行梯度乙醇至水：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯十1/2乙醇混合液-→ 100%乙醇→+95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇-→30%乙醇→苏木素染色液-0.01%盐酸→ 米二米二送/十米二/2%00%00 6.2.9封片 滴加2滴中性树胶封片。 6.2.10镜检 H-E染色后，明视野显微镜下观察。 6.2.11结果判定 缘化（参见附录B)；判定为MBV阳性。 6.3聚合酶链反应(PCR) 6.3.1DNA提取