SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3583—2013 白尾病检疫技术规范 Quarantineprotocolforwhitetaildisease 2014-03-01实施 2013-08-30发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3583—2013 #言 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准采用国际动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中2.2.6章WhiteTail Disease。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、王群、张曼、郑小龙、孙明君、郑腾、孙涛、梁成珠、徐彪。 SN/T3583—2013 白尾病检疫技术规范 1范围 本标准规定了白尾病的临床诊断、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)方法、嵌套式反转录-聚合酶 链式反应（nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。 本标准适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 WTD：白尾病（whitetaildisease） WMD：肌肉白浊病（whitemuscledisease) MrNV：罗氏沼虾野田村病毒（Mac） hiumrosenbergiinodavirus) XSV：超小型病毒（extrasmallvirus） RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应 transcription- nerase ainreaction) T-PCR nRT-PCR：嵌套式RT-PCR(N ested OD：光密度（opticaldensity） ra-aceticacid) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylen e dian DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） ISH：原位杂交（In-situhybridisation） TEA：三乙醇胺（triethanolamine) SSC：标准柠檬酸盐（standardsalinecitrate） NBT：氯化硝基四氮唑蓝（NitrotetrazoliumBluechloride) BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate) 4设备 4.1PCR仪。 4.2电泳仪。 4.3凝胶成像仪。 4.4切片机。 4.5烘箱。 4.6 恒温恒湿培养箱。 SN/T 3583—2013 4. 7 冷冻离心机。 4. 8 电子天平。 4. 9 高压灭菌锅。 5 试剂 5. 1 Trizol。 5.2 dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。 Taq酶：5U/μL，一20℃保存，避免温度剧烈变化。 5. 3 5.4 M-MLV反转录酶：6U/μL，一20℃保存，避免温度剧烈变化。 5.5 引物。 5.5.1 RT-PCR检测MrNV用引物： F1:5'-GCG-TTA-TAG-ATG-GCA-CAA-GG-3'; R1:5'-AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG-3'。 扩增MrNV衣壳蛋白425bp的片段。 5.5.2 RT-PCR检测XSV用引物： F2:5'-CGC-GGA-TCC-GAT-GAA-TAA-GCG-CAT-TAA-TAA-3'; R2:5'-CCG-GAA-TTC-CGT-TAC-TGT-TCG-GAG-TCC-CAA-3'。 扩增XSV衣壳蛋白546bp的片段。 5.5.3nRT-PCR检测MrNV用内引物： F3:5'-GAT-GAC-CCC-AAC-GTT-ATC-CT-3'; R3:5'-GTG-TAG-TCA-CTT-GCA-AGA-GG-3'。 扩增MrNV衣壳蛋白205bp的片段。 5.5.4nRT-PCR检测XSV用内引物： F4:5'-ACA-TTG-GCG-GTT-GGG-TCA-TA-3'; R4:5'-GTG-CCT-GTT-GCT-GAA-ATA-CC-3'。 扩增XSV衣壳蛋白236bp的片段。 5.5.5 ISH引物序列： KS:5'-TCGAGGTCGACGGTATC-3'; SK:5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3'。 5.6 Triton X-100。 5.7 Davidson's固定液。 5.8 DEPC。 5.9 无RNA酶的蛋白酶K。 5. 10 正常山羊血清。 5. 11 羊抗地高辛碱性磷酸酶。 5.12 NBT。 5. 13 BCIP。 6 采样 6. 1 样品的选择 根据GB/T18088规定的数量取样，应首选腹部和尾部发白的个体。 2 SN/T3583—2013 6.2样品的保存 样品使用无菌生理盐水洗涤，放人无菌试管中，一70℃保存。用于RT-PCR检测的样品也可放置 于70%乙醇中运送至检测实验室。 6.3最佳取样器官和组织 除了眼柄和肝脏，所有的组织都可用来进行检测。从腹肢提取的RNA也可用来检测MrNV和 XSV，而不必破坏虾体。 7检测方法 7.1现场诊断方法 7.1.1体表特征：染病虾体最初变得不透明，外观呈白浊现象，尤其是在腹部。最初在腹部第二、第三 腹节出现肌肉白浊现象，并逐渐向前后同时伸展，最严重时尾部肌肉亦发白。在最初病症出现5d后死 亡率达到最高。参见附录A。 7.1.2行为特征：染病虾体游泳和进食能力减弱，蜕皮异常，形态似云母片。 7.2临床诊断方法 WTD会引起对虾的腹部变白，这种临床表象对WTD不是特异的，但是WTD会伴随着高死亡率。 7.3RT-PCR方法 7.3.1核酸的提取 采用Trizol法提取RNA（附录B)，也可采用等效的商业化RNA提取试剂盒。 7.3.2RT-PCR反应 反应体系为50μL，可参照一步法RT-PCR反应试剂盒说明书进行，包括10pmolMrNV特异性引 物（F1和R1）或XSV特异性引物（F2和R2），10ng-100ngRNA模板（通过测定OD260进行定量）， 10mmol/LdNTP各1μL，酶2μL，剩余为DEPC水。反应条件为52℃30min；95℃2min；94℃ 40s，55℃40s，68℃1min，30次循环；68℃10min。RT-PCR产物使用1%琼脂糖凝胶，1×TBE电 泳缓冲液中电泳（含EB，见附录C），使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察 结果。 7.3.3对照的设立 7.3.3.1阳性对照：感染MrNV/XSV的组织样品。 7.3.3.2空白对照：RT-PCR时不加样品但是包括其他主要混液的反应体系。 7.3.4结果判定 MrNV阳性对照会出现一条425bp的扩增片段，XSV阳性对照会出现一条546bp的扩增片段，空 白对照没有该核酸带。在阳性对照与空白对照均成立的情况下，待测样品在相应的位置上有带，则结果 为MrNV或XSV阳性；无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空白对照不成立， 需要重新进行试验。 3 SN/T3583—2013 4nRT-PCR 7. 4 7.4.1nRT-PCR反应 第二次扩增，反应体系和条件同7.3。反应体系包括：第一次扩增PCR反应产物2μL，（若第一次 PCR有产物，则1：10稀释后，取2μL），nRT-PCR反应混合液（附录C)20μL（或者采用商业化的试剂 盒，加人MrNV特异性引物（F3和R3)或XSV特异性引物（F4和R4)各20pmol,Taq酶1μL)。反应 条件：95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30次循环；72℃5min。RT-PCR产物使用 1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭），使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察 结果。 7.4.2 对照的设立 同7.3.3。 7.4.3 结果判定 第二次扩增，MrNV、XSV阳性对照分别出现205bp、236bp的扩增片段，空白对照没有该扩增带， 在阳性对照、空白对照均成立的情况下，待测样品在目的大小位置上有带，则结果为MrNV或XSV阳 性；无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空 白对照不成立，需要重新进行试验。 7.5 测序 将PCR扩增产物进行测序，并与参考序列（参见附录D)进行相似性比对，对检测结果进行判定。 7.6 原位杂交方法（ISH) 7.6.1 探针的标记 探针通过PCRDIG标记试剂 盒标记 引物 KS、SK mol/L。PCR反应条件为：94℃ 10 2min;94℃45s，55℃45s,72℃ min，30次循环：72℃ 10min. 用PCR产物纯化试剂盒对PCR产 物进行纯化，再利用地高辛标 记试剂盒进行标记，得到地高辛标记的 DNA探针。 7.6.2 操作步骤 7.6.2.1 将染病仔虾浸泡于无醋酸的Davidson's固定 液（附录C)中24h~48h。 7.6.2.2 根据标准程序，石蜡包埋组织，切成7μm切片。将组织切片平铺于带正电荷的载玻片上。 7.6.2.3 60℃烘片2h，用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%的乙醇梯度脱水。 7.6.2.4 将玻片浸人DEPC水配制的Tris/HCI(0.2mol/L，pH7.4)缓冲液