SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3542-2013 光合细菌菌剂中沼泽 红假单胞菌计数方法 Enumeration of Rhodopseudomonas palustris inphototrophic bacteria product 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 涂层查真材 SN/T 3542—2013 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、 集美大学、厦门市农产品质检中心、厦门大学。 本标准主要起草人：王群力、陈双雅、刘军义、周常义、杨涛、刘棠、彭小莉、黄河清。 SN/T3542—2013 光合细菌菌剂中沼泽 红假单胞菌计数方法 1范围 本标准规定了光合细菌菌剂中活的沼泽红假单胞菌的测定方法。 本标准适用于进出口光合细菌菌剂中沼泽红假单胞菌有效活菌数的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris 属于细菌域（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目 （Rhizobiales）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas），能进行不产氧 光合作用，含细菌叶绿素a和类胡萝卜素。 3.2 光合细菌菌剂phototrophicbacteriaproduct 以沼泽红假单胞菌为菌种，采用有机、无机原料，经发酵培养而制成的活菌制品。分液体和固体制 剂两种，以菌液形式存在的称为液体制剂，以某种固体物质作为载体吸附菌液而成或采用某种工艺干燥 而成的称为固体制剂。 设备和材料 4.1 光照恒温培养箱：30℃±1℃，带日光型荧光灯或白炽灯，照度不小于20001x。 4.2 显微镜：100×。 4.3 均质器：旋转式均质器或拍击式均质器或等同功能的均质器。 4.4 高压灭菌器。 4.5 玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器。 4.6 抽滤瓶。 4.7 真空泵。 4.8 滤膜：直径47cm，微孔径0.45μm。 SN/T3542—2013 4. 9 天平：感量0.1g。 4.10 微需氧培养罐：能维持1%氧浓度的透明培养容器装置。 4.11 吸管：1mL，分刻度0.1mL；10mL，分刻度1mL。 4.12 可调移液器：10μL~100μl，100μL~1000μ。 4.13 螺口试管：容量13mlL。 4. 14 灭菌平Ⅲ：直径90mm，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。 4. 15 灭菌的样品处理器具：镊子、剪刀、勺子。 5 培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯试验用水应符合GB/T6682的规定。 5.1 M-AT培养基：见附录A中A.1。 5.2 光合细菌分离琼脂：见A.2。 5.3磷酸盐缓冲稀释液：见A.3。 5.4 AT培养基：见A.4。 5.5革兰氏染色液：见A.5。 5.6 培养基和试剂的配制遵循SN/T1538.1和SN/T1538.2的要求。 固体制剂中有效活菌数的测定 6.1 方法提要 光合细菌固体菌剂中有效活菌数的测定是通过选择性增菌（MPN法）、分离、生化鉴定等方法对其 中活的沼泽红假单胞菌进行测定。 6.2测定程序 沼泽红假单胞菌MPN测定程序见图1。 样品25g+225mL稀释液 10倍梯度稀释，选取3管×3个稀释度，加入M-AT 30℃±1℃，光照厌载，5d~10d 光合细菌分离琼脂 30℃±1℃，光照厌氧，2d3d 挑取可疑菌落 革兰氏染色 碳源利用试验 30±1℃，光照厌氧，3d~5d 报告结果 图1 沼泽红假单胞菌MPN法测定程序示意图 2 SN/T3542—2013 6.3样品制备 6.3.1无菌操作称取25g样品，放人无菌均质杯中，加人225mL灭菌磷酸盐缓冲液，以8000r/min ～10000r/min的转速均质1min～2min；或放入无菌均质袋中，加入225mL灭菌磷酸盐缓冲液，用 拍击式均质器拍打1min2min，制成1：10的样品匀液。 6.3.2用1mL灭菌吸管吸收1：10稀释液1mL，沿管壁缓缓注入加入装有9mL灭菌稀释液的试管 中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），混合均匀，制成1：100样品匀液。 6.3.3根据对样品含菌量估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。 6.4接种培养 6.4.1根据对样品含菌情况的估计，选择3个连续适宜的稀释度，最高稀释度应能达到获得阴性终点。 每个稀释度接种3管装有M-AT培养基的螺日试管，每管接种1mL,拧紧试管帽。置30℃土1℃光照 培养5d。如有沼泽红假单胞菌生长，培养液变棕红色至红色，如不变色，继续培养5d。 6.4.2将所有培养基变棕红色至红色的试管上下颠倒摇匀.用3mm接种环沾取一环，接种光合细菌 分离琼脂平板，置微需氧培养罐，30℃土1℃光照培养2d~3d，观察菌落形态。 6.4.3沼泽红假单胞菌在光合细菌分离琼脂上的典型菌落特征为红色、红褐色或深红色，无粘液。从 每个平板上挑取2个典型或可疑菌落，分别接种到光合细菌分离琼脂斜面上，置微需氧培养罐，30℃士 1℃光照培养2d~3d，取纯培养物按6.5进行鉴定。 6.5鉴定 6.5.1革兰氏染色 挑取斜面上的纯培养物，进行革兰氏染色。沼泽红假单胞菌为革兰氏阴性杆菌。 6.5.2碳源利用试验 革兰氏染色阴性的杆菌培养物分别接种以苯甲酸钠、柠檬酸钠甲酸钠、葡萄糖、酒石酸钠为唯一有 机碳源的AT培养基。置微需氧培养罐，30℃±1℃光照培养3d～5d。如试验碳源培养基变红，则判 定利用该碳源阳性；如不变色，则为阴性。沼泽红假单胞菌生化特性见表1。 表1 沼泽红假单胞菌属细菌生化特性 培养基 苯甲酸钠 柠檬酸钠 甲酸钠 葡萄糖 酒石酸钠 生化特性 + + 注：十表示阳性；一表示阴性。 6.5.3判定 在光合细菌分离琼脂平板上具有典型菌落，革兰氏染色阴性，且符合表1中生化特性，判定为沼泽 红假单胞菌。 6.6结果报告 计算沼泽红假单胞菌阳性管数，应用MPN表（见附录B），查出并计算样品中的沼泽红假单胞菌 MPN值，报告为每g样品中沼泽红假单胞菌的最近似值，以MPN/g表示。 3