SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3527—2013 化学品 胚胎毒性测试 植入后大鼠 全胚胎培养法 Chemicals--Embryotoxicitytest-Post-implantationembryoculturemethod 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3527—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了欧洲动物试验替代方法研究中心（EuropeanCentrefortheValidationofAlternative Methods，ECVAM)《体外植人后大鼠全胚胎培养法测试胚胎毒性》（DB-ALM：INVITTOXprotocol embryotoxicitytestinginpost-implantationembryocultureINVITTOXn123)(英文版） 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：程艳、崔媛、谢文平、陈会明、艾文超、马萍。 1 SN/T3527—2013 化学品用 胚胎毒性测试植入后大鼠 全胚胎培养法 1范围 本标准规定了植入后大鼠全胚胎培养方法检测化学品胚胎毒性的方法目的、方法原理、试验描述 试验体系、数据分析/预测模型、受试物、材料、方法和潜在胚胎毒性预测、评估。 本标准适用于化学品胚胎毒性的筛查。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 半数致畸浓度ICs0 formalformations;ICso 50%的胚胎出现畸形的受试物浓度。 2. 2 3T3细胞半数抑制浓度ICs0<3T3） for inhibition of thegrowth of 3T3 cells;IC50(313) 50%的3T3细胞生长受抑制的受试物浓度。 2. 3 最大致畸浓度ICmaxformalformations;ICma 导致最高畸形率的受试物最低浓度。 2. 4 总体形态学评分无效应浓度ICNOEC fortotal morphological score;ICxoEc 对总体形态学评分没有效应的受试物最高浓度。 3方法目的 植入后大鼠全胚胎培养方法检测胚胎毒性是为了识别引起畸形最终导致胚胎毒性的物质。 4方法原理 4.1试验中采用含有1～5个体节的大鼠胚胎，比采用更大时期的胚胎对外源性物质更敏感。在48h 的培养过程中，是器官形成的重要时期，例如心脏发育、神经管封闭、耳眼形成、肱动脉和肢芽形成。受 试物在这个阶段进行染毒，可能会导致机体生长和发育迟缓或者造成一个或多个器官畸形。 4.2胚胎在旋转的培养箱中进行培养，有利于培养液与其上方的气体交换。由于胚胎发育对于氧气的 需要越来越大，气体交换对于培养液的最佳氧饱和度非常重要。 4.3测试完成后，评估胚胎的形态，将对照组和试验组的胚胎进行比较，得到受试物胚胎毒性结果。 5试验描述 5.1 试验终点和终点检测 5.1.1大鼠胚胎形态：形态变化（胚胎总体观察、包括体节个数、分化滞后、特定的畸形）。 1 SN/T 3527—2013 5.1.2大鼠胚胎功能：功能变化（心脏搏动、卵黄粪循环和尿囊循环）。 5.1.3大鼠胚胎发育：胚胎生长发育（卵黄囊直径、冠臀长、头长）。 5.1.4细胞成活力：细胞成活（心脏博动、卵黄囊循环和尿囊循环）。 2终点检测值 5.2 畸形检测IC和ICm>：总体形态学得分（TMS)的ICvox。 5.3 试验体系 5.3.1大鼠全胚胎培养。取9.5d孕龄的大鼠胚胎，每个胚胎培养皿加人2ml.大鼠血清.采用合适的 溶剂溶解受试物（如：Hanksbalancod-salt-solution，HBSS，DMSO、醇）.在胚胎置人培养Ⅲ之前，向 能干扰培养中胚胎的发育。 一致。 5.3.3设置相当数目的平行样.并对受试物浓度进行测试， 5.3.4培养48h后.每个胚胎都被转移到含有HBSS的培养Ⅲ中（37℃）.按照培养的先后顺序对胚 胎进行评分.测试终点的评分见9。4 数据分析/预测模型 6 6.1全胚胎培养方法采用精细的形态学评分系统，评价化学品作用48h后胚胎出现畸形或发育迟缓 的体征或胚胎的死亡。在ECVAM进行验证试验之前，化学品毒性分级主要基于发生的效应性质.并 由化学品最低有效浓度得出。在ECVAM进行验证试验过程中，生物统计评价表明评分系统不能多重 应用.因此开发了两套预测模型PMI和PM2） 6.2因为预测模型一（PM1)只考虑分化和发育方面的参数.故开发了预测模型二（PM2）。PM2纳入 了分化的小鼠成纤维细胞（3T3）的细胞毒性数据，参考了胚胎于细胞检测方法（具体见10.3）。 6.3两套预测模型用于在验证试验中对检测的化学品进行胚胎毒性分级，胚胎毒性分为三级：无毒性、 弱毒性和强度性。 6.4为了比较体外试验与体内试验之间不同的分级标准，采用了应急统计（contingencystatistics）来 评价数据的准确性、方法的预测性和对于待测物进行3级毒性分级的精密性。更多详细信息见10.3。 7受试物 药品、消费类产品、工农业用品、食品添加剂及污染物。 8材料 8.1 大鼠品系 8.1.1通过了阳性和阴性对照化学品的质量检查.并且有大量胚胎数目的大鼠品系可用于本测试。可 用0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/l.和1mg/L的5-氟尿嘧啶进行阳性对照试验，1000mg/L的青霉 素G钠进行阴性对照试验。 8.1.2 2大鼠在温度20℃～24℃.湿度50%70%的SPF动物房中进行培养，随意进食，不限饮水。 2 SN/T3527—2013 8.1.3每天检查大鼠的一般行为，保持其健康。7～10周龄的雌鼠至少适应2周后，与至少10周龄的 雄鼠交配。为了制备大鼠血清，雄鼠体重至少250g。 8.2 仪器设备 8.2.1 解剖显微镜。 8.2.2 镊子。 8.2.3 手术剪。 8.2.4 移液器。 8.2.5 培养皿。直径约100mm。 8.2.6 带旋转设备的37℃培养箱（最好内带观察显微镜） 8.2.7 旋转培养箱：容量至少10mL 8.3 化学品和培养液 Hank's平衡盐溶液（Hanksbalancedsalsolution，HBSS)：含0.185g/L的CaClz、8.0g/L 8.3.1 NazHPO，、0.060g/L的KH,PO.、6℃保存，以上试剂均为分析纯。 8.3.2 DMSO（分析纯）。 8.3.3 乙醇（分析纯）。 8.3.4 麻醉剂T61。 8.3.5 COz（工业等级）。 8.3.6 5-氟尿嘧啶。 8.3.7 青霉素G钠。 8.3.8 无菌真空血液收集管。 8.4 血清制备 雄性大鼠采用CO，麻醉后，开腹胫，找到焦动脉，用无菌真空血液收集管从主动脉收集血液，在 1min之内完成。1800rpm离心 5min后吸取血清于冰上保存。采集完所有样品后，再次于1800rpm 20℃储存备用，使用前于37℃热融。 离心3min，收集血清，于56℃热灭活30mim。 9方法 9.1受试化学品浓度 9.1.1每个胚胎培养中加人2mL大鼠血清。采用合适的溶剂溶解受试化学品（如：HBSSDMSO或 乙醇）。在胚胎置入培养箱之前，向培养血清中加入标准体积的受试物溶液，对照组中加人同体积的溶 剂。加入溶液的体积已在预试验中证明不会干扰培养箱中胚胎的发育。培养箱中溶剂的最大浓度是 1%水相溶液（HBSS），0.125%的DMSO，以及0.2%的乙醇。培养箱通气后，将胚胎放人培养箱中（详 见9.2.3)。 9.1.2每个母体的胚胎均匀的分布在对照组和各个试验组中，并且每个浓度组最开始的平均体节数 一致。 9.1.3 设置相当数目的平行样，并对受试物浓度进行测试。 9.2测试过程 9.2.1 交配过程：雌性大鼠生长在12h明暗交替的环境中，上午6时至下午6时指定为黑暗时期。下