SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3523—2013 化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶 抑制活性试验方法 Chemicals-Fish assay for oestrogenic and androgenic activity, and aromatase inhibition 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3523—2013 目 次 前言 引言 范围 术语和定义 3 方法局限性说明 测试原理 4 5 测试可接受性标准 6 方法描述 6.1 仪器 6. 2 水 6. 3 测试溶液 6. 4 鱼的饲养 6.5 预暴露和鱼的选择 7测试设计 7. 1 般说明 7. 2 测试浓度的选择 8试验过程 8. 1 受试鱼的选择与称量 8.2 暴露条件 8.2.1 时间 8.2.2 饲养 8.2.3 灯光和温度 8.3 分析检测和测量的频率 8.4 观察 8.4.1 一般说明 8.4.2 存活率 8.4.3 行为和表观 8.4.4 鱼的人道处死 8.4.5 第二性特征的观察 8.4.6卵黄蛋白原(VTG) 9数据和报告 9.1 采用方差分析（ANOVA)对生物标志物响应进行评价 测试结果报告 9.2 SN/T3523—2013 对于测试结果的解释和接受 10 附录A（资料性附录） 卵黄蛋白原分析的样品收集的推荐程序 附录B（资料性附录） 检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青鳞的第二性特征的评估· : 18 附录C（资料性附录） 鱼类内分泌筛选测试实验条件： 23 附录D（资料性附录） 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板· 附录E（资料性附录） 可接受的稀释水的一些化学特性 :27 附录F（资料性附录） 卵黄蛋白原加强样品和分析方法间参比标准 附录G（资料性附录） 统计分析流程.. 29 参考文献 30 SN/T 3523—2013 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准参考了经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment， OECD)TG230：《21天鱼测试：雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性短期筛选测试》（21-dayFishAssay：A Short-Term Screening forOestrogenicand Androgenic Activity，and Aromatase Inhibition)(英文版)。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：程艳、崔媛、陈会明、谢文平、马萍。 SN/T 3523—2013 引言 环境水平的化学物质与内分泌系统相互作用，危害人类和野生动物，故需要发展和验证鱼类检测内 分泌干扰活性物质的技术和方法。1998年，OECD开始着手修订已有测试指南，并发展新的测试指南， 以筛选和检测潜在的内分泌干扰物。其中一项重要研究内容就是发展鱼类内分泌干扰测试方法指南。 21天鱼类内分泌干扰筛选测试（TG230)经过了广泛的验证试验，包括针对选定的化学物质，在三种鱼 种系（黑头呆鱼、日本青鳞和斑马鱼）生物模型上，多个实验室间进行的有关雌激素和芳香酶抑制物质 ([1]～[5])测试的方法相关性和可靠性分析测试；雄激素测试可在黑头呆鱼和青鳞模型上进行，但不能 在斑马鱼模型上进行。测试指南（TG230)不适用于测试抗雄激素物质。验证工作已由测试方法指南组 国家协调机构（theNationalCoordinatorsoftheTestGuidelineProgramme）指定的专家组完成［6]。 本测试并不识别荷尔蒙干扰的特定机制，因为受试动物拥有完整的下丘脑-垂体-性腺（HPG)轴，会对影 响HPG轴的物质产生不同程度的反应。鱼类短期生殖毒性测试（TG229）包括黑头呆鱼生育力和（在 适当的情况下）性腺组织观察，以及在本测试（TG230)中所包括的所有测试终点。TG229提供了对通 过不同机制（包括内分泌特征)影响生殖能力的化学物质的筛选方法。这一点在选择最合适的测试指南 时，优先考虑。 本测试方法描述了种体内筛选测试方法，性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼放在一起，在其生命 周期中暴露于化学品一段有限的时间（21天）。在21天暴露期结束时，根据所用物种，在雄性和雌性鱼 上对一种或两种生物标志物终点进行测试，作为测试化学物质的雌激素，芳香酶抑制或雄激素活性指 标。这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性特征。对黑头呆鱼、日本青鳞和斑马鱼可进行卵黄蛋白原 测试，而第二性特征只能在黑头呆鱼和日本青上测试。此生物测试作为特定内分泌干扰模式的体内 筛选测试，其应用可在"OECD内分泌干扰化学物质测试和评价框架”中看到 SN/T3523—2013 化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶 抑制活性试验方法 1范围 本标准规定了化学品对鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法的方法局限性说明、测试原 理、测试可接受性标准、方法描述、测试设计、试验过程、数据和报告对于测试结果的解释和接受。 本标准适用于化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性测试 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 承载率loadingrate 单位体积水的鱼的湿重。 2. 2 承载密度stockingdensity 单位体积水的鱼的数目。 2. 3 卵黄蛋白原 vitellogeninVTG 卵黄蛋白原是一种蛋黄蛋白的磷脂糖蛋白前体，一般产生于所有卵生动物的性成熟雌体中。 2. 4 最大耐受浓度 maximum tolerated concenfration MTC 最大耐受浓度，代表大约L的10%。 2.5 HPG轴hypothalamic-pituitary-gonadal axis 下丘脑-垂体-性腺轴。 3方法局限性说明 3.1卵黄蛋白原（Vitellogenin，VTG)通常受循环的内源性雌激素的刺激，由雌性卵生脊椎动物的肝脏 产生。卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前提，一且在肝脏中产生，由血流进人卵巢，并被发育中的雌性配子吸 收并改变。卵黄蛋白原在未成熟的雌性和雄性鱼的血浆中几乎检测不到，因为它们缺乏足够的循环雌 激素，但在受外源性的雌激素的刺激下，肝脏能够合成并分泌VTG。 3.2VTG的测量能够检测不同雌激素作用模式的化学物质，对雌激素类化学物质的检测，有可能通过 测量雄性鱼的卵黄蛋白原的产生，并已在科学同行文献中有大量报道[7]。也有证明表示卵黄蛋白原的 产生也能由暴露于芳香化的雄激素引起[8]～[9]。在雌性体内的雌激素循环水平的降低，例如通过抑制 转化内源性雄激素为天然雌激素17β-雌二醇的芳香酶，会引起卵黄蛋白原水平的降低，这一点被用来检 测具有芳香酶抑制性质的化学物质[10]～[11]。 已经建立了卵黄蛋白原与雌激素/芳香酶抑制的响应 的生物相关性，并已被大量文献所报道。然而，在雌性体内VTG的产生有可能也会被系统毒性和非内 分泌干扰毒性作用模型所影响，例如肝毒性。 1