SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3492-2013 传染性肌肉坏死检疫技术规范 Quarantine protocol for infectious myonecrosis 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3492-—2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了OIE《水生动物疾病诊断手册（2011年版）》第2.2.3章，选取OIE手册中临床诊断内 容和分子诊断中关于反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应检测方法的 内容。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫 局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：兰文升、郑晓聪、史秀杰、黄继徽、唐连飞、贾鹏、王津津、叶奕优、王红英。 SN/T3492—2013 传染性肌肉坏死检疫技术规范 1范围 本标准规定了传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV)的反转录-聚合酶链式反 应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应的检测方法。 本标准适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectiousmyonecrosis，IMN)的检疫和诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 反转录-聚合酶链式反应reverse asechainreaction;RT-PCR RNA在逆转录酶的作用下，在适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行聚合酶链 式反应。 3. 2 实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应real-timeRT-PCR 在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，荧光PCR仪器的监测系统可以接收到 PCR反应中的荧光信号，每扩增一条DNA链，就有个荧光分子形成使荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。 3. 3 Ct值cyclethreshold Real-timeRT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4主要试剂和材料 4.1除特别说明外，本标准仅使用确认为分析纯的试剂。 4.2水：应符合GB/T6682中一级水的规定。 4.3Taq酶：-20℃保存。 4.4反转录酶：-20℃保存。 4.5RNase抑制剂：一20℃保存。 4.6T7RNA聚合酶：-20℃保存。 4.7 DNaseI：-20℃保存。 SN/T 3492—2013 4.8pGEM-TEasyVector:-20℃保存。 4.9Pstl限制性内切酶：一20℃保存。 ）NTP：含CTP、GTP、ATP、TTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存 4. 10 4. 11 dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，一20℃保存。 4. 12 引物 浓度为20umol/1.，一20℃保存，其序列如下： 正义引物(IMNV218F):5'-GCTGGACTG TAT TGGTTGAG-3'; 反义引物(IMNV682R)：5'-AACCAAGTTCTTCTTCTCCAGTT-3'; 正义引物（4587F):5'-CGACGCTGCTAACCATACAA-3'； 反义引物（4914R)：5'-ACTCGGCTGTTCGATCAAGT-3'； 正义引物(4725NF):5'-GGCACATGCTCAGAGACA-3'； 反义引物（4863NR)：5'-AGCGCTGAGTCCAGTCTTG-3'； 正义引物(IMNV412F):5'-GGA CCTATC ATA CATAGC GTT TGC A-3’; 反义引物(IMNV545R)：5'-AACCCATATCTATTGTCG CTGGAT-3’； 探针（IMNVp1）： 5'-6FAM-CCA CCT TTA CTT TCA ATA CTA CAT CAT CCC CGG-TAMRA-3'; 浓度。 4. 13 病毒RNA抽提试剂盒或其他抽提RNA的等效产品。 4.14 溴化乙锭（EB）。 4.15 溴酚蓝DNA上样液（见附录A)。 4. 16 TAE电泳缓冲液（见附录A）。 4. 17 核酸分子量标准参照物。 5 器材和设备 5. 1 PCR扩增仪。 5. 2 实时荧光定量PCR仪器（7500RealTimePCRSystem或其他等效设备）。 5.3 电泳仪(0V~3V)和水平电泳槽。 5. 4 微量移液器和微量移液器吸头。 5. 5 凝胶成像仪。 5.6 恒温培养箱。 5.7 普通冰箱和低温冰箱。 5. 8 匀浆器。 5. 9 台式高速离心机和离心管。 5.10 制冰机。 5. 11 电泳仪。 6 临床症状的诊断 6.1 行为变化 出现环境胁迫时，严重感染的虾表现为游动缓慢，持续进食；将虾体解剖，发现此时病虾的胃肠一般 2 SN/T3492—2013 充满食物。 6.2发病症状 急性发病期虾样的骨骼肌呈现点状或者片状坏死区域，尤其是尾部腹节和尾肢，病灶区肌肉发白及 不透明症状。显微镜观察，肌肉组织出现浮肿和淋巴器官中血细胞纤维化，在坏死的肌纤维和纤维化的 血细胞之间有液体堆积，并常伴有深色包涵体 7取样和样品处理 7.1样品的运输与保存 如果暂时不能检测，应该将样品置于一80℃冰箱中保存。 7.2取样 样品尽可能取后期幼体和成虫期虾样，取样器官是对虾条纹肌、结缔组织或血细胞（参见附录B）， 可以把不超过5头的样本混合做混样。取每只虾的肌肉组织20mg～50mg，合计100mg～250mg样 品，研磨均匀待用。 7.3制样 将取好样品混合均匀后，再取20mg～50mg加人适量RNA抽提试剂盒中的裂解液，15℃下，用 匀浆器将1.5mL离心管中样品均浆成糊状，取140μL制备样品，同步制备已知感染IMNV和已知未 感染IMNV的虾样分别作为阳性和阴性对照，然后，用病毒RNA抽提试剂盒抽提病毒RNA（提取步骤 参照试剂盒操作手册）。如果无法获得已知阳性样品，用第7章的方法制备RNA阳性对照物用来代替 阳性样品抽提的核酸。 7.4RNA样本的保存 制备的RNA样本应尽快进行RT-PCR或real-timeRT-PCR，如果暂时不能进行下步反应，应该 将样本置于一80℃保存备用，保存期不超过1周。 8RNA阳性对照物的构建 8.1用RT-PCR从IMNV基因组扩增DNA片段 方法参见9.2）扩增464bp的DNA片段，克隆至pGEM-TEasyVector载体，并转化大肠杆菌 EscherichiacoliJM1o9细胞，然后按照质粒抽提试剂盒的方法抽提质粒。 8.2RNA阳性对照物的制备 将上一步得到的重组质粒用PstI酶切使之线性化，作为T7RNA聚合酶的转录模板，37℃条件下， 1μg质粒在20μl反应体系作用2h（反应体系参见表1）。转录产物然后用DNasel在37℃酶切30 min（反应体系参见表2），然后加人2.5μL0.5mol/LEDTA，混匀，80℃加热处理2min，热处理灭活 DNasel，即得到合成的RNA对照物，置于一80℃冰箱备用，可以作为后续RT-PCR和Real-TimeRT PCR检测方法的阳性参考标准。