SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3485—2013 牛焦虫病检疫技术规范 Quarantine protocol for bovine babesiosis and theileriosis 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3485—2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010年版）中2.4.2牛巴贝斯虫病的 血虫体检查、聚合酶链式反应(PCR)、间接免疫荧光试验与微量补体结合试验，并细化了血虫体检查的 结果判定、PCR方法的实验操作与结果判定及补体结合试验的预备试验等内容。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国宁夏出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本标准的主要起草人：石建平、孟日增、郝俊虎、宋战昀、孟庆峰、刘阳、鱼海琼、刘金华、王伟利。 1 SN/T3485—2013 牛焦虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实 验室检疫技术。 本标准适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1678梨形虫病病原鉴定方法 SN/T2685泰勒氏焦虫检疫规范 3疾病概述 焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虫所引起的家畜各种疾病的总称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病 和泰勒氏焦虫病，牛巴贝斯虫病参见附录A泰勒氏焦虫病参见附录B。 4诊断技术 4.1病原学检查 4.1.1血虫体检查 4.1.1.1样品采集 4.1.1.1.1血液样品 无菌采集耳尖或尾尖采血样，也可颈静脉无菌采集用EDTA（1mg/mL）作抗凝剂的抗凝血，4℃ 保存。 4.1.1.1.2组织标本 无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。 4.1.1.1.3动物户体 死亡动物应在其死亡后24h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外，还可采取大脑皮层、肾、 肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。 4.1.1.2血涂片的制备 用洁净的载玻片端边缘蘸一小滴血，再用另-一端边缘光滑的载玻片做推片，将推片的一端置于血滴 SN/T 3485—2013 之前，待血液沿推片端缘扩散后，均匀推成薄血膜，也可取一小滴血液（约50uL)滴在干净的载玻片上， 自然风干形成厚血片。 4.1.1.3组织涂片的制备 脏器涂片的制作可用一块洁净的载玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组 织.沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下--层组织。涂片风干后无水甲醇固定5min，再用10%姬姆 萨（配制参见附录C的C.1）染色20min~30min。 4.1.1.4血涂片或组织涂片的染色 涂片待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20min～30min；厚血片与组织涂片 风干后，80℃烘箱固定5min，10%姬姆萨染色15min~20min。 4.1.1.5病原鉴定 按SN/T1678中规定的方法进行实验和结果判定。 4.1.2牛巴贝斯焦虫聚合酶链式反应 4.1.2.1i 试剂与材料 4.1.2.1.1 牛巴贝斯焦虫参考虫株：由指定单位提供 4.1.2.1.310倍PCR缓冲液：含50mmol/LKCl.10mmol/LTris-HCl(pH8.5),2.5mmol/L MgCl0.001%明胶。 4. 1.2.1. 41 10mmol/LdNTP混合液：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP4种脱氧核苷酸。 4.1.2.1.5 蛋白酶K：浓度为10mg/ml。 4. 1. 2. 1. 6 6引物 本试验选用SSrRNA基因序列作为PCR扩增区，设计两条引物P1、P2，引物位置和序列如下： P2(699~670)5'-CCAAAGTCAACCAACGGTACGACAGGGTCA-3* P1、P2引物扩增片段为272bp。 4.1.2.2其他试剂 实验用水按GB/T6682中规定准备，Tris碱、EDTA、SDS、苯酚、NaCI、HCI、乙醚和乙醇等均为市 售分析纯。 4.1.2.3器材和设备 PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织 匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。 4.1.2.4操作方法 4.1.2.4. 1 样品采集与处理 4.1.2.4.1.1样品采集 取发病或可疑动物外周EDTA抗凝血20mL。 2 SN/T3485—2013 4. 1. 2. 4. 1. 2 2样品处理 血液样品需离心取沉淀以去掉血浆蛋白，再用0.01mol/LpH7.2的PBS充分洗涤、离心，血球泥 大约2mL，快速冻融3次，虫体与细胞碎片用TE缓冲液洗涤两次，于12000r/min离心5min，收集沉 淀备用。 4.1.2.4.2对照样品制备 4.1.2.4.2.1阳性样品：经培养增殖的参考虫体。 4.1.2.4.2.2阴性样品：无虫体感染的正常牛红细胞。 4.1.2.4.3基因组DNA抽提 4.1.2.4.3.1新鲜抗凝血，离心弃去上清液。 ELS裂解液（配制见C.2)（1mL细胞压积加人6mL~10mL裂解液），轻轻吹打混匀。 4.1.2.4.3.31500r/min离心5min8min，离心弃去上层红色清液， 4.1.2.4.3.4红细胞裂解完全后收集沉淀部分，加人0.5mLTE离心，若裂解不完全可重复步骤 4.1.2.4.3.2和4.1.2.4.3.3。 4.1.2.4.3.5加20%SDS，蛋白酶K（10mg/mL）至终浓度100ug/mL，用一玻璃棒温和地将酶混人 黏滞的细胞裂解液中。 4.1.2.4.3.6将细胞裂解液置于60℃水浴3h，不时旋转黏滞溶液。 4.1.2.4.3.7 将溶液冷却至室温，加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和颠转混匀3min。 4.1.2.4.3.8 3室温6000r/min离心15min，取上层水相到另一1.5mL离心管中。 4.1.2.4.3.9 加等体积饱和酚，混匀，6000r/min离心15min，取上层水相到另一离心管中。 4.1.2.4. 3. 10 加等体积酚/三氯甲烷，轻轻混匀，6·000r/min离心15.min，取上层水相到另一离心管 中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 4. 1. 2. 4. 3. 11 1加等体积三氯甲烷，轻轻混匀，6000r/min离心15min，吸取上层水相到另一离心 管中。 4.1.2.4.3.12 加1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 4.1.2.4.3.13 待絮状物出现后，6000r/min离心15min，弃上清液。 4.1.2.4.3.14 沉淀用75%乙醇洗涤；12000r/min离心15min，弃上清液。 4.1.2.4. 3.15 室温下挥发或瞬时离心吸弃乙醇后，按0.1mL细胞加人1mL的比例加入TE缓冲 液。将其置于摇床平台上，4℃温和振荡过夜，直至DNA完全溶解，储存备用， 也可用等效的商品化DNA提取试剂盒制备DNA样品，操作按说明书进行。 4.1.2.4.4PCR扩增DNA 4.1.2.4.4.1 PCR反应系统 PCR反应液组分见表1。 3 SN/T3485—2013 表1PCR反应液组分 成分 用量 10×浓缩缓冲液 5 μL dNTP 4 μL. 引物 P1(10 μmol/L) 1 μl. 引物P2(10μmol/L) 1 μl, rTaq酶(5U/μl) 0. 25 μL DNA模板 3 μL ddH,0 35. 75 μL 总体积为50μL，瞬时离心。 4.1.2.4.4.2 PCR反应程序 95℃，10min预变性；92℃，1min：60℃.3min；72℃，3min；35个循环；72℃保温10min；扩增 产物4℃保存。 4.1.2.4.4.3PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 用新鲜的1×TBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶（EB浓度1ug/mL)并制板。将琼脂糖凝胶 板水平放入电泳槽，使1×TBE电泳缓冲液刚好没过胶面。将5μLPCR产物和1μL上样缓冲液 （6XLoadingBuffer）混匀后加人样品孔。同时加人DNA标准分子量对照品（DL2000），5V/cm电泳 30min，当溴酚蓝接近底部时终止电泳。 紫外灯下观察核酸带并判断结果，或用凝胶成像分析仪分析结果 4.1.2.5结果判定标准 4.1.2.5.1阳性对照只出现一条约272bp的DNA条带，阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验 成立。 4.1.2.5.2若待检样品经电泳出现约272bp的DNA条带可判为阳性；若待检样品扩增经电泳未出现 DNA条带，或者出现的条带不是272-bp判为阴性；出现其他条带，应判为非特异性扩增，应重做试验。 4.2血清学检测 4.2.1牛巴贝斯焦虫间接免疫荧光试验（IFA） 4.2.1.1J 血涂片的制备 采颈静脉血制备血涂片。采血时加人适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA），用5倍10倍体积PBS 至少洗涤3次，除去血浆蛋白与免疫球蛋白。洗涤后，将感染红细胞重悬于2倍体积PBS中，加入1% 牛血清白蛋白(B