SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2206.9—2013 化妆品微生物检验方法 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌 Determination of microbiological in cosmetics- Part 9:Bile-tolerant gram-negative bacteria 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2206.9—2013 前言 SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌； 第3部分：肺炎克雷伯氏菌； 第4部分：链球菌； 第5部分：肠球菌； 第6部分：破伤风梭菌； 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原； 第8部分：白色念珠菌； 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌； 第10部分：金黄色葡萄球菌 PCR法； 第11部分：金黄色葡萄球菌 多重实时荧光PCR法； 第12部分：绿脓杆菌 PCR法； 第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 本部分为SN/T2206的第9部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：吕敬章、汤慕瑾、万志刚、洪小柳、赵芳、张恒、刘慧玲、王小玉、游淑珠、石建华。 I SN/T2206.9—2013 化妆品微生物检验方法 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌 1范围 SN/T2206的本部分规定了化妆品中胆汁酸耐受革兰氏阴性菌的定性和定量检测方法。 本部分适用于化妆品中胆汁酸耐受革兰氏阴性菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1538.1培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 胆汁酸耐受革兰氏阴性菌 bile-tolerant gram-negative bacteria 一类能耐受胆汁酸，在结晶 晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VioletRed BileGlucoseAgar,VRBGA)上 生长的革兰氏阴性菌，包括肠杆菌科、假单胞菌属、气单胞菌属的一 一些细菌。 4仪器、器具 4.1 水浴箱：45℃±1℃。 4.2 温度计：1℃~55℃，分刻度0.1℃。 4.3 培养箱：36℃±1℃。 4.4 吸管：1mL、5mL和10mL。 4.5 拍击式均质器。 4.6 无菌均质杯或无菌均质袋。 4.7 接种环：直径3mm。 4.8 天平：感量0.1g。 4.9 锥形瓶：100mL、250mL、500mL。 4.10 培养皿：直径90mm。 4.11 显微镜。 4.12 高压灭菌器。 SN/T2206.9—2013 5培养基和试剂 5.1一般要求 培养基的质量控制应符合SN/T1538.1和SN/T1538.2的要求，也可使用符合SN/T1538要求的 商品化培养基。 5.2 主要培养基 5.2.1 大豆酪蛋白卵磷脂吐温80液体培养基，也称SCDLP液体培养基（SCDLP)：见A.1。 5.2.2 肠杆菌增菌肉汤（EEB)：见A.2。 5.2.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）：见A.3。 6检测步骤 6.1定性检测 6.1.1 样品处理 无菌操作准确取10g或10mL样品，置盛有90mLSCDLP液体培养基的无菌均质杯中，以 8000r/min~10000r/min均质1min2min，或置于盛有90mLSCDLP液体培养基的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打1min~2min。无菌操作将样品转至250mL锥形瓶，于室温20℃~25℃静 置2h～5h后，即为样品混合物。 6.1.2增菌 轻轻摇动样品混合物，并吸取10mL转种于100mLEEB内，于36℃士1℃增菌培养24h48h。 6.1.3分离 用接种环取增菌液一环，划线接种于VRBGA上，于36℃1℃培养18h～24h。胆汁酸耐受革 兰氏阴性菌在VRBGA上通常呈现粉红色至红色的菌落，部分非肠杆菌的菌落可呈现无色至灰白色。 6.1.4结果报告 分离琼脂VRBGA上有菌落生长，则报告10g或10mL样品中检出胆汁酸耐受革兰氏阴性菌；分 离琼脂VRBGA上无菌落生长，则报告10g或10mL样品中未检出胆汁酸耐受革兰氏阴性菌。 6.2计数方法（MPN计数法） 6.2.1样品处理 见6.1.1。 6.2.2稀释 轻轻摇动样品混合物，用无菌吸管吸取1mL样品混合物，沿管壁缓缓注人装有9mLSCDLP的试 管中（注意吸管的尖端不要触及SCDLP的液面），振摇试管使其混合均匀，制成1：100的样品稀释液。 换用一支无菌吸管，按上述操作，依次制成10倍递增样品稀释液。制备样品稀释液至样品接种完毕，全 过程不超过15min。 2 SN/T2206.9—2013 6.2.3增菌 液的接种量为1mL（如接种量超过1mL，则用双料的EEB)，于36℃土1℃增菌培养24h～48h。 6.2.4分离 每管分别用接种环取增菌液一环，划线接种于VRBGA上，于36℃土1℃培养18h～24h。在 VRBGA上有菌落生长者为阳性。 6.2.5胆汁酸耐受革兰氏阴性菌最可能数（MPN）报告 根据阳性管数，检索MPN表，见附录B，报告每g（mL）样品中胆汁酸耐受革兰氏阴性菌的 MPN值。 3 SN/T2206.9—2013 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 SCDLP液体培养基（SCDLP） A.1.1成分 酪蛋白陈 大豆蛋白陈 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5 卵磷脂 吐温80 7.0g 蒸馏水 1000 A.1.2制法 先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解，调pH至7.2~7.3后分装， 121℃高压灭菌15min。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。 A.2 肠杆菌增菌肉汤（EEB） A.2.1成分 蛋白陈 10.0g 葡萄糖 8.0g 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 2.0g 牛胆盐 20.0g 煌绿 0.015g 蒸馏水 1000mL A.2.2 制法 应使用纯净的牛胆盐和煌绿，减少对受损伤目标菌生长的抑制。将各成分加入蒸馏水中，加热煮 沸，分装每瓶90mL。制成的培养基为绿色，可放置2℃～8℃冷藏，4周内使用。 A.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA） A.3.1 成分 蛋白陈 7.0 g 酵母膏 3.0 g 4 SN/T2206.9—2013 葡萄糖 10.0 g 氯化钠 5.0g 0.03 g 中性红 3号胆盐 1.5 g 结晶紫 0.002g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000mL A.3.2制法 各成分溶于水，加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，使用前制备。 5