SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2121—2014 代替SN/T2121-2008 流行性造血器官坏死检疫技术规范 Quarantine protocol for epizootic haematopoietic necrosis 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2121—2014 前 #創言 本标准根据GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T2121一2008《流行造血器官坏死病检疫技术规范》。 本标准与SN/T2121-2008相比，主要技术差异如下： 增加了临床症状的描述； 增加了间接免疫过氧化物酶法； 一修改了综合判定。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘、贾鹏、郑晓聪、何俊强、马晓文、王津津、于力、史秀杰、兰文升、陈兵、 王红英。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 SN/T2121—2008。 I SN/T2121—2014 流行性造血器官坏死检疫技术规范 1范围 本标准规定了流行性造血器官坏死的临床症状、病原分离、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和 间接免疫过氧化物酶法的检测方法。 本标准适用于流行性造血器官坏死的诊断检测和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3概述 流行性造血器官坏死（Epizootichaematopoieticnecrosis.EHM是一种由流行性造血器官坏死病 毒（Epizootic haematopoietic neg) rosis viru us，EHNV)引起有鳍鱼类以全身性临床或亚临床感染为特征 的病毒性传染病（参见附录A）。 4试剂和材料 4.1水：符合GB/T6682中一级水的规格 4.2EHNV参考株：由指定单位提供 4.3细胞系：选蓝鳃太阳鱼成纤维细胞系（Bluegillfry,BF-2）、胖头鳞细胞系（FatheadMinnow， FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞系（EpitheliomaPapulosumCyprini，EPC）或大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系 (Chinook SalmonEmbryo,CHSE-214)之- 4.44-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）。 4.5兔免抗EHNV抗体或鼠抗EHNV抗体：由指定单位提供。 4.6辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠免疫球蛋白（IgG）。 TaqDNA酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 4.8dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。 4.9引物：浓度为40μmol/L。其序列如下： M151:5'-AAC CCG GCT TTC GGG CAG CA-3' M152:5°-CGGGGCGGGGTTGATGAGAT-3" 扩增EHNV主要衣壳蛋白基因321bp片段。 M153:5'-ATG ACC GTC GCC CTC ATC AC-3 SN/T2121—2014 M154:5'-CCA TCG AGC CGT TCA TGA TG-3" 扩增EHNV主要衣壳蛋白基因625bp片段、 4.10 异丙醇：分析纯，一20℃预冷。 4.11矿物油：要求无DNA酶和RNA酶.用于无热盖的PCR扩增仪。 4.12 TritonX-100。 5 器材和设备 5.1 96孔细胞培养板、不同规格细胞培养瓶。 5.2 倒置显微镜。 5.3 恒温培养箱。 5.4 普通冰箱和一80℃超低温冰箱。 5.5 组织研磨器。 5.6 离心机和离心管。 5.7 PCR扩增仪。 5.8 水平电泳仪。 5.9 微量移液器及吸头。 5.10 紫外观察灯或凝胶成像仪。 5.11 制冰机。 5.12 高压灭菌器 5.13 酶标仪。 6 临床症状 病鱼表现为失去平衡、体表变黑，但鳍和鳃通常无肉眼可见病变。少部分病鱼的肾脏、肝脏或脾脏 肿大，肝脏有坏死灶，坏死灶可见白色病灶或黄色损伤。肾脏、肝脏和脾脏坏死表现为成片的、多点的或 大面积的凝结和液化。 7 取样和制样 7.1 待检鱼的采集和处理 按照GB/T18088要求取样。首选发病和死亡的鱼作为采样对象。体长大于10cm的鱼浸于70% 乙醇中30s，体长小于或等于20cm的鱼浸于70%乙醇中5s，然后用无菌水冲洗。实验室检测条件应 符合GB19489的规定。 7.2 组织的采取和处理 每5～10尾鱼作为一个小样，每个小样至少取0.1g组织。体长超过6cm的鱼，取肝、肾和脾；体长 在3cm~6cm的鱼，取所有内脏；体长小于3cm的鱼，去头和尾后，取余下鱼体。用于细胞培养和酶联 溶液（见B.1)固定。 2 SN/T2121—2014 8病毒分离培养 8.1组织匀浆液的制备 对组织称量后，用无菌手术剪刀将其剪碎并研磨成糊状，用细胞培养液（含1000IU/mL青霉素和 800μg/mL链霉素）按照10mL/g比例将研磨后的组织重悬（将此组织液称为1：10稀释度）。15℃ 孵育2h～4h或4℃孵育6h~24h。12000r/min离心30min，收集上清液。 8.2病毒分离 8.2.1单层细胞的制备 弃培养瓶内细胞培养液1（见B.2），用无菌PBS（见B.3）漂洗细胞2次，加入胰酶-EDTA消化液（见 B.4)消化细胞。消化完毕，吸出胰酶-EDTA消化液，加人细胞培养液2（见B.5），将细胞吹散成单个细 胞，加人细胞板，置于适当温度，使细胞生长至单层。 8.2.2接种细胞 将1：10组织匀浆上清液再作两次10倍稀释。将1：10、1：100和1：1000稀释度的组织上清 培养液体积的十分之一，每个稀释度至少接种3孔。阳性对照（接种EHNV参考株）和空白对照（细胞 培养液1)各3孔。 8.2.3培养和观察 22℃培养，倒置显微镜连续观察6d。空白对照细胞形态正常，阳性对照出现明显细胞病变 （CPE），表明分离体系正常。若接种待检样品的细胞出现CPE，应立即进行鉴定。若接种待检样品的 细胞未出现细胞病变，需进一步盲传。 8.2.4盲传 将8.2.3中的待检样品细胞培养物冻融三次，7000r/min、4℃离心15min，收集上清液。将上清 液接种至新鲜单层细胞，22℃培养，倒置显微镜连续观察6d。 8.2.5结果判定 8.2.5.1阳性对照细胞可见明显CPE，表现为局部区域细胞开始裂解，周围细胞收缩变圆，并最终全部 脱落。空白对照细胞生长正常。若阳性对照或空白对照不成立，则应换用敏感细胞和新的组织上清液 重新实验。 8.2.5.2当接种待检样品的细胞出现与阳性对照相似的CPE，则判定为阳性。否则，判定为阴性。 9聚合酶链式反应（PCR） 9.1样品 待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物 9.2设立对照 从样品处理起，每步均需设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取EHNV参考株细胞培养物作为 3