SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1675--2014 代替SN/T1675—2011 真鲷虹彩病毒病检疫技术规范 Quarantineprotocol for red sea bream iridovirusdisease(RsIVD) 2014-07-14发布 2015-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 真鲷虹彩病毒病检疫技术规范 SN/T1675—2014 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045) 总编室：（010)68533533 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1 字数24千字 2015年12月第一版 2015年12月第一次印刷 印数1—1100 * 书号：155066·2-29363 定价18.00元 SN/T1675-2014 前言 本标准按照GB/T1.1-—2009给出的规则进行起草。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2012年版，第2.3.07章）。 本标准与OIE方法相比，主要区别如下： 删除了电子显微镜镜检内容； 一删除了OIE手册中真鲷虹彩病毒病预防和控制内容； -删除了OIE手册中关于流行病学内容。 本标准代替SN/T1675--2011《真鲷虹彩病毒病检疫技术规范》。 本标准与SN/T1675一2011相比，主要技术差异如下： 删除了电子显微镜镜检内容； 规范性附录中增加了文件中所使用的主要试剂及配方； 重新编排了格式。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫 局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：兰文升、吴文忠、王津津、于力、郑小聪、贾鹏、刘、史秀杰、何俊强、叶亦优、 王红英、郑腾。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1675--2005,SN/T1675--2011。 SN/T 1675-2014 真鲷虹彩病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了真鲷虹彩病毒病（Redseabreamiridovirusdisease，RSIVD)临床诊断、病原分离、聚 合酶链式反应、间接免疫荧光实验的检测方法。 本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的诊断、监测和检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682.分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3概述 真鲷虹彩病毒病是引起养殖海水鱼类的重要疾病，引起多种海水鱼类发病，被列人世界动物卫生组 织(OIE)水生动物疫病名录。RSIVD的典型性特征为脾肾肿大（参见附录A）。 缩略语 4 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect） IFAT：间接免疫荧光抗体试验（indirectfluorescentantibodytest） ISKNV：传染性脾肾坏死病毒（infectiousspleenandkidneynecrosisvirus） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RSIVD：真鲷虹彩病毒病（redseabreamiridoviraldisease） RSIV：真鲷虹彩病毒（redseabreamiridoviralvirus） HE染色法：苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining） 5仪器和设备 5.1超净工作台。 5.2生化培养箱。 5.3荧光倒置显微镜。 5.4PCR仪。 5.5 5冷冻离心机。 5.6 凝胶成像仪。 SN/T·1675—2014 5.7DNA电泳系统。 6试剂和材料 6.1 石鲈鳍细胞系（Gruntfincellline，GF）。 6.2 RSIV参考株：由指定单位提供。 6.3 细胞生长液：含10%胎牛血清的L-15细胞培养液（含Eagle's平衡盐溶液）。 6.4 胎牛血清(FBS)。 6.5 抗RSIV的单克隆抗体：由指定单位提供。 6.6 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠的抗体。 6.7 PCR反应相关试剂。 6.8 引物： 1-F:5'-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3' 1-R:5'-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3 扩增片段长度为：570bp。 4-F:5"-CGG GGG CAA TGA CGACTA CA-3" 4-R:5'-CCG CCT GTG CCT TTT CTG GA-3" 扩增片段长度为：568bp。 7抽样 抽样数量及方式根据GB/T18088进行。样品包括活的、发病的、濒死的鱼，取其脾和肾用于检测。 以不超过5条鱼为一个小样。 8临床诊断 8.1 临床症状 感染鱼活动能力差、贫血、鳃丝有出血点和脾脏肿大、 8.2 组织病理检测 8.2.1 制备脾脏的组织涂片经Giemsa染色（见B.1），可见异常肿大的细胞。 8.2.2制备脾脏、心脏或肠制备的组织涂片，经过HE染色（见B.2)可见异常肿大的细胞。 9.病毒分离 9.1 对照设立 RSIV参考株作为阳性对照，未感染的细胞作为阴性对照。 9.2 样品接种细胞 9.2.1 将采集的脾和肾组织研磨成为匀浆，用L-15培养基（含10%FBS、1000IU/mL青霉素和 2 SN/T1675-—2014 800μg/mL链霉素）将研磨后的组织稀释10倍（1：10），置于25℃培养箱中孵育24h。 9.2.2胰酶（见B.3)消化的GF细胞接至96孔板，制备单层细胞，培养24h。 9.2.313000g离心15min，收集组织匀浆上清液。 1：10、1：100、1：1000组织液分别接种到96孔板，每孔中组织上清液与细胞维持液的比例为1：10。 同时设立2孔阳性对照（接种RSIV参考株）和2孔阴性对照（未接种病毒的细胞），置于24℃～26℃ 培养。 9.3细胞培养的观察 9.3.1显微镜下观察细胞变化，持续观察7d。 9.3.2如果阳性对照一直没有CPE，则要用新的敏感细胞和样品重新做病毒分离。 9.3.3 如果在细胞培养中出现CPE，立即进行IFAT试验和（或)PCR鉴定。 9.3.4如果接种7d后没有观察到CPE（阳性对照已出现CPE），需盲传一次。传代程序如下：将接种 中，培养和观察7d。 9.4结果判定 9.4.1接种被检样品的细胞或者盲传后的细胞出现CPE，则初步判定为病毒分离结果阳性。 9.4.2如果仅有阳性对照出现CPE，被检样品首次接种细胞和盲传后均没有CPE，则判定为病毒分离 阴性。 10 间接免疫荧光抗体试验 10.1 样品及对照设定 10.1.1病毒分离出现CPE的细胞培养物为待检样品。用未接种的单层细胞作为阴性对照，感染 RSIV参考株的单层细胞作为阳性对照。 10.1.2鱼脾脏组织为待检样品。阳性对照所用的鱼脾脏组织风干和固定的切片可以从OIE参考试验 室获得；健康鱼的脾脏组织制备的涂片作为阴性对照。 10.2试验步骤 10.2.1印片和涂片的制备 10.2.1.1在细胞培养孔中置人一片盖玻片并加人新鲜培养的细胞，24℃～26℃培养24h，制备印片。 10.2.1.2无菌条件下，将10倍稀释的待检病毒悬液接种到细胞培养孔；同时设立阳性对照和阴性对 照；25℃培养24h~72h。 10.2.1.3吸出细胞培养液，用PBS（见B.5)漂洗3次，然后用预冷固定液（见B.4）漂洗3次，空气中干 燥，用预冷丙酮固定10min。 10.2.1.4单层细胞在空气中干燥至少30min，然后立刻做下一步实验或置于一20℃保存。 10.2.1.5病料组织涂片的制备。放尽鱼血，取脾脏组织压抹于载玻片上，制备成涂片。将涂片在空气 中干燥20min，预冷丙酮固定10min。 3 SN/T 1675—2014 10.2.2印片和涂片的处理和显色 10.2.2.1用0.01mol/L、pH7.2的PBST(含0.05%吐温80)将抗RSIV单克隆抗体稀释到工作浓度。 加人稀释后的抗RSIV的单克隆抗体，每2cm²细胞加250μL。37℃湿盒孵育30min。用PBST清洗 玻片3次。 10.2.2.2加入异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗鼠的荧光抗体，每2cm²细胞加250μL。37℃湿盒孵 育30min。用PBST清洗玻片3次。用pH8.5的甘油封片。 10.3结果判定 10.3.1阳性对照和阴性对照应完全成立。 10.3.2当细胞层上有特异的黄绿色荧光，整个细胞质充满弥散性的荧光，判定IFAT结果为阳性。 10.3.3当细胞层只有微弱的绿色背景，判定IFAT结果为阴性。 11PCR检测 11.1# 样品及对照设定 11.1.1病毒分离出现CPE的细胞培养物为待检样品。用感染RSIV参考株的细胞培养物为阳性对 照，用未感染RSIV的细胞为阴性对照。 11.1.2鱼的脾组织作为待检样品。用感染RSIV的鱼组织作为阳性对照，用健康鱼的组织作为阴性 对照。 11.2实验步骤 11.2.1核酸抽提 将450μL细胞培养物或组织悬液加人1.5mL的离心管，加450μLCTAB溶液（见B.6)并混匀， 25℃作用2.5h。从11.1的被检样品中提取DNA。再向离心管中加人600μL抽提液1