SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1673--2013 代替SN/T1673-2005 传染性皮下和造血器官坏死 检疫技术规范 Quarantine protocol for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1673—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1673一2005《对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程》。 本标准与SN/T1673--2005相比，除编辑性修改外主要技术性变化如下： -增加了临床诊断； 一增加了实时荧光PCR方法； 增加了斑点杂交方法； -增加了原位杂交方法； 增加了综合评定， 本标准主要参考OIE标准《水生动物疾病诊断手册》（2009年版)第2.2.2章中介绍的方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国海南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张娜、何俊强、黄纪徽、卓金焕、郑枢、史秀杰、庄广儒、曾建红。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1673—2005。 I SN/T1673—2013 传染性皮下和造血器官坏死 检疫技术规范 1范围 本标准规定了进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的现场检疫和聚合酶链式反应（PCR)、实 时荧光PCR方法、原位杂交方法和斑点杂交方法实验室检验方法。 本标准适用于进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 IHHN：传染性皮下和造血器宫坏死 IHHNV：传染性皮下和造血器官坏死病毒 PCR：聚合酶链式反应 Real-TimePCR：实时荧光PCR RDS：慢性矮小残缺综合症 4概述 IHHN的流行病学、病原特性等参见附录A。 5实验室诊断 5.1 仪器和设备 5.1.1PCR扩增仪。 5.1.2 紫外观察灯或凝胶成像仪。 5.1.3 荧光定量PCR仪。 5.1.4 高速冷冻离心机。 5.1.5 玻璃研磨棒或塑料研磨棒。 5.1.6 水浴锅：室温至100℃。 5.1.7 塑料封口机：可满足5cm以上杂交袋热塑封口，溶液溢出到电阻丝或外壳上时不会发出漏电。 1 SN/T1673—2013 5.1.8 暗盒：可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替。 5.1.9 硝酸纤维素膜。 5.1.10 杂交袋。 5.1.11 电炉或其他加热设备：可满足200mL2000mL水在散口容器中沸腾10min。 5.1.12 程控组织脱水机或常规手工脱水。 5.1.13 程控组织包埋机或常规手工包埋。 5.1.14 展片水浴锅：室温～50℃。 5.1. 15 切片烘干机：室温～100℃。 5.1.16 切片染色缸。 5. 1. 17 切片保湿孵育箱。 5.2试剂和材料 5.2.1 所用水若非注明，应符合GBJT6682中级水的规格。 5.2.2若非注明，本标准使用试剂为分析纯。 5.2.3聚合酶链式反应(PCR)扩增反应引物 a）PCR扩增引物： 389F:5'-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT TA-3" 389R:5'-GGC-CAA-GAC-CAAAAT-ACG-AA-3" 浓度为40μmol/L，扩增长度为389bp的基因片段（参见附录B)。 b）PCR扩增引物： 77012F:5'-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3" 77353R:5'-TCG-TAC-TGG-CTG-TTC-ATC-3 浓度为40μmol/L，扩增长度为356bp的基因片段。 c）PCR扩增引物： 392F:5'-GGG-CGA-ACC-AGAATC-ACT-TA-3" 392R:5'-ATC-CGG-AGG-AAT-CTGATG-TG-3" 浓度为40μmol/L，扩增长度为392bp的基因片段。 d）PCR扩增引物： 309F:5'-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3" 309R:5'-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3* 浓度为40μmol/L，扩增长度为309-bp的基因片段。 e）PCR扩增引物： MG831F:5'-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3' MG831R:5'-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT-3" 浓度为40μmol/L，扩增长度为831bp的基因片段。 5.2.4实时荧光PCR扩增引物和Taqman探针 a）实时荧光PCR引物： 下游引物(IHHNV1688R)5'-GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA-3" 引物浓度为7.5μmol/L。 b）Taqman探针：探针浓度为7.5μmol/L 5'FAm-ACC-AGA-CAT-AGA-GCT-ACA-ATC-CTC-GCC-TAT-TTG-TAMRA 3' 探针浓度为7.5μmol/L。 2 SN/T 16732013 5.2.5对照设立 阳性对照：取含有已知IHHNV的对虾组织作为阳性对照，或由国家质量监督检验检疫总局 a） 指定单位提供。 b) 阴性对照：取已知未含IHHNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。 空白对照：取等体积的水代替模板作为空白对照。 5.2.6 抽提液I：饱和过的重蒸酚：三氮甲烷：异戊醇按25：24：1的比例混合。 5.2.7 抽提液Ⅱ：三氯甲烷和异戊醇按24：1的比例混合。 5.2.8dNTP：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L6×上样缓冲液。 5.2.9Taq酶：5U/μL；MgCl2:25.0mmol/L；一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.2.10EB(核酸染色剂）。 5.2.111 DNA标准分子量。 荧光PCR反应混合液：TaqManUniversalPCRMasterMix（美国应用生物系统公司产品或等 5.2.12 效产品），包含AmpliTaqGoldDNApolymerase、AmpEraseUNG、dNTPs、dUTP以及优化的PCR 反应成分。 5.2.13DIG标记的核酸探针（德国Boehringer-Mannheim公司产品或等效产品）。 5.2.14碱性磷酸酶标记的DIG抗体（RocheDiagnostics1-093-274或等效产品）。 5.2.15核酸探针斑点杂交阳性对照；已知受IHHINV感染、组织病理学上有明显IHHN病灶且核酸 探针斑点杂交检测呈明显阳性结果的对虾样品组织匀浆上清液或血淋巴。 5.2.16核酸探针斑点杂交阴性对照：已知未受THHNV感染且核酸探针斑点杂交检测呈明显阴性结 果的对虾样品组织匀浆上清液或血淋巴。 5.3临床症状 患有急性IHHN的细角滨对虾（Litopenaeusstylirostris)摄食明显减少，外观及行为表现异常，患 病对虾在养殖池中缓缓上升到水面静止后翻转继而又缓慢沉到水底，腹部向上，出现这种行为的对虾 在几小时内不断重复这个过程，直到体力不支或被其他健康对虾攻击和吞食。感染期的细角滨对虾表 皮上皮，特别是腹部背板接合处经常出现白色或浅黄色的斑点（该斑点的形状及出现部位与对虾白斑综 合征的特征性白斑不同)，使对虾看上去体色斑驳。继而这种斑点会逐渐消褪。同时，感染了IHHNV 的细角滨对虾和斑节对虾（Penaeusmonodon)在濒死时体色常偏蓝，腹部肌肉不透明。 凡纳滨对虾（Litopenaeusuannamei)感染IHHNV后表现为RDS，主要影响是患病对虾生长缓慢， 表皮畸形，但死亡率很低。养殖的细角滨对虾和斑节对虾也会患RDS。稚虾或大一些的凡纳滨对虾患 慢性矮小残缺综合症的严重程度及流行与幼体或仔虾阶段的早期感染有关。患病稚虾表现额角弯曲、 变形，触角鞭毛皱起，表皮粗糙或残缺。患RDS的稚虾大小差异很大，且一般比正常的对虾短小。 5.4聚合酶链式反应(PCR) 5.4.1取样和制样 5.4.1.1取活虾或濒死的对虾组织作为样品，死亡2h后不可采用。处理前要将样品放在冰上。如果 2h以后才能处理，应将样品保存在10倍以上体积的95%乙醇中，放置在室温下可保存1个月。 5.4.1.2仔虾或稚虾：取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和锻子去除眼睛、头胸甲、所有 的胸部附器和头部以后的腹部。 和腹部两面三刀侧的附肢，如触角、颚足、步足和游泳足，用小剪刀剪碎。样品保存在一20℃。 取血淋巴时，先用1mL针管吸取500μL10%的柠檬酸盐（见附录C的C.1)溶液，然后在针管前 插上一个26号的针头。抓住对虾，使腹部朝上。将针头水平地插人第一和第二对游泳足之间，并一直 插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。血淋巴样品需保存在一70℃。 3 SN/T1673—2013 5.4.2病毒DNA抽提 充分混合至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相；加人700μL提取液Ⅱ，充分混合至少30s。 12000r/min离心5min，取上层水相；加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混匀后，一