SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1474—2014 代替SN/T1474—2004 传染性造血器官坏死病检疫技术规范 Quarantine protocol for infectious haematopoietic necrosis 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1474—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1474一2004《传染性造血器官坏死病毒逆转录聚合酶链式反应操作规程》。 本标准与SN/T1474一2004相比，除编缉性修改外，主要技术变化如下： 修改了标准的名称； -增加了临床症状、病毒分离、中和试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验； 一删除了原标准的套式逆转录聚合酶链式反应方法，替换为逆转录聚合酶链式反应方法。 本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》（2012年版）第2.3.4章，主 要修改如下： 原文中Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A； 删除了原文第5节中检测方法的选择依据和第6节传染性造血器官坏死病无疫区的相关 内容。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、河南省水 产技术推广站。 本标准主要起草人：贾鹏、何俊强、杨俊兴、杨雪冰、郑晓聪、于力、王津津、刘、花群义、史秀杰、 兰文升、陈兵、王红英。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1474—2004。 I SN/T 1474—2014 传染性造血器官坏死病检疫技术规范 1范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病临床症状、病毒分离、逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附 试验、中和试验、间接免疫荧光试验的检测方法。 本标准适用于传染性造血器官坏死病的诊断、监测和检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3概述 传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病病 毒（Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV)感染鲑、鳟鱼类后引起死亡的一种病毒性传染病， 被世界动物卫生组织（OIE)列人水生动物疫病名录，我国将其列为二类动物疫病（参见附录A）。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect) dNTPs：脱氧核糖核苷酸(deoxynucleotidetriphosphates) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）； EPC：鲤鱼上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprini) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) ELISA：酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） FHM：肥头鲤细胞系（fatheadminnow） FBS：胎牛血清（fetalbovineserum） FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） HEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase） IHN：传染性造血器官坏死病（infectioushaematopoieticnecrosis） IHNV：传染性造血器官坏死病毒（infectioushaematopoieticnecrosisvirus） IPNV：传染性胰脏坏死病毒（infectiouspancreasnecrosisvirus） 1 SN/T1474—2014 RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction)） 仪器和设备 5.1 组织研磨器或无菌研钵。 5.2 恒温培养箱。 5.3 倒置荧光显微镜。 5.4 PCR扩增仪。 5.5 水平电泳仪。 5.6 凝胶成像仪。 5.7 酶标仪。 5.8 普通冰箱和一80℃超低温冰箱。 5.9 降温离心机。 5.10 微量移液器。 5.11 二级生物安全柜。 5.12 剪刀、镊子、离心管、PCR管和细胞培养器血等耗材。 6 试剂和材料 6.1 水：符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2 IHNV参考株：由指定单位提供。 6.3 细胞系：FHM、EPC。 6.4 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 6.5 TaqDNA酶：-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 6.6 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。 6.7 RNA酶抑制剂：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 6.8 逆转录酶：-20℃保存，避免温度剧烈变化， 6.9 RT-PCR用引物，浓度为20mmol/L，序列如下： F1:5'-AGAGATCCCTACACCAGAGAC-3' R1:5'-GGT GGT GTT GTT TCC GTGCAA-3' 扩增IHNV糖蛋白基因中大小为693bp的片段。 6.10 抗体：抗IPNV血清、抗IHNV血清和单克隆抗体。 6.11 异硫氰酸荧光素（FITC)：一20℃避光保存。 6.12 TritonX-100和Tween-20。 6.13 HRP标记的抗鼠或抗免抗体。 临床症状 病鱼初期表现为游动迟缓、昏睡，有时表现为狂游、转圈游动等。病鱼体色发黑、腮丝苍白、眼球突 出、腹部膨胀、鳍基充血，不透明的粘液状管型粪便悬挂于肛门。剖解可见病鱼肝脏、脾脏和肾脏等器官 苍白贫血，胃内空虚，肠道等器官有出血点。存活下来的鱼常出现脊柱畸形。 2 SN/T14742014 8采样和制样 8.1样品和靶器官的采集 样品包括活的、发病的、濒死的鱼和鱼卵，采样数量按照GB/T18088规定执行。体长小于4cm的 鱼苗取整条鱼；4cm～6cm的鱼苗取肾脏在内的所有内脏；体长大于6cm的鱼取脑、脾和肾，成熟雌鱼 还需取其卵巢液；鱼卵仅取卵膜。由于肝脏和胃肠中的酶易将IHNV降解，尽量避免采集。实验室检 测条件应符合CB19489的规定。 8.2 2小样的制备及处理 最多以10条鱼为一个小样，每个小样至少取0.5g组织。对组织称量后，用无菌手术剪刀将其剪碎 并研磨成糊状，用细胞培养液1（见B.1)按照10mL/g比例将研磨后的组织重悬（将此组织液称为 1：10稀释度）。卵巢液不必匀浆，用细胞培养液1将其稀释2倍。15℃孵育4h或4℃孵育过夜。 4℃、12000r/min离心15min，取上清用于后续实验。 9诊断方法 9.1病毒分离 9.1.1单层细胞的制备 用胰酶一EDTA消化液（见B.3）消化EPC或FHM细胞后，用细胞培养液2（见B.2）重悬细胞，加 入细胞培养板，25℃培养，使细胞生长至单层。 9.1.2中和IPNV 用细胞培养液2将1：10稀释度组织上清液连续稀释至1：100和1：1000。将1：10、1：100和 1：1000组织稀释液分别与适当浓度的抗IPNV血清等量混合，15℃孵育1h。抗IPNV血清中和效 价不低于2000。若样品来自于IPNV无疫区或确定未感染IPNV，此步骤可以省略。 9.1.3接种细胞 将以上3个不同稀释度的组织上清液分别接种至新鲜的EPC或FHM单层细胞，每个稀释度至少 3孔，每孔中组织上清液与细胞维持液的比例为1：10。同时，设立阳性对照和空白对照，阳性对照孔中 7 d~10 d。 9.1.4盲传 首次接种细胞7d～10d后未出现CPE，需进一步盲传。将细胞培养物反复冻融3次，收集至无菌 离心管。4℃、7000r/min离心15min或用直径0.45μm滤器滤除细胞碎片，取上清液。用细胞培养 液2将上清液稀释至1：10和1：100，将上清液、1：10和1：100稀释液接种于新鲜的EPC或FHM 单层细胞，至少3孔，组织上清液接种量与孔内细胞培养液比例为1：10。同时，设立阳性对照和空白 对照。15℃培养，倒置显微镜下连续观察7d～10d。 9.1.5结果判定 9.1.5.1IHNN感染EPC或FHM细胞后，可出现典型CPE，表现为局部细胞变圆、皱缩和裂解，以此 3 SN/T 1474—2014 为中心周围细胞的病变范围扩大，形成明显空斑，最终细胞呈拉网状直至全部悬浮脱落。 9.1.5.2若样品首次接种细胞或盲传后细胞出现典型CPE，则判定为阳性。若样品盲传后细胞仍未观 察到CPE，则判定为阴性。 9.1.5.3若阳性对照或阴性对照不成立，换用敏感细胞，需重新实验。 9.2逆转录聚合酶链式反应（RT-PGR） 9.2.1对照设立 从核酸抽提起，每步实验均需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用IHNV的病毒悬液作为 阳性对照，用正常细胞悬液作为阴性对照，以DEPC水代替样品作为空白对照。 9.2.2核酸抽提 取细胞培养物250μL至无RNA酶的1.