SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1198-2013 代替SN/T1198—2003 转基因成分检测 马铃薯检测方法 Detection of genetically modified components- Potatoes test methods 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1198—2013 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1198--2003《马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法》。 本标准与SN/T1198一2003相比，主要技术变化如下： 将原标准名称进行了修订； 一-将规范性引用文件进行了修订； 删除了原标准中抽样的具体步骤，改为参照GB/T19495.7《转基因产品检测抽样和制样方 法》进行抽样； 增加了鉴定检测马铃薯品系范围，马铃薯EH92-527-1品系转基因定性成分的检测； 一增加了实时荧光PCR检测方法。 本标准参照欧盟联合研究中心转基因食物及饲料参考实验室（Communityreferencelaboratoryfor GMfoodandfeedBiotechnology&GMOsUnit)中转基因马铃薯PCR检测方法，增加了转基因马铃薯 EH92-527-1品系鉴定检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：高宏伟、林超、刘彩霞、孙撤、朱水芳、曹际娟。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1198—2003。 1 SN/T1198-2013 转基因成分检测 马铃薯检测方法 1范围 本标准规定了马铃薯及其加工产品中转基因成分检测的PCR方法和实时荧光PCR方法。 本标准的筛选检测适用于马铃薯及其加工产品中转基因成分的定性检测。 本标准的鉴定检测适用于马铃薯EH92-527-1实时荧光PCR的品系鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。九是注日期的引用件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方 GB/T19495.2转基因产品检测一实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3. 1 转基因transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的幼能DA序，通过生物工程技术，使其在该物种中进 行表达，以便使该物种获得新的品种特征。 3. 2 内源基因endogenousgen 在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因 该基因可用于对基因组中某一目的 基因的定量分析。 3. 3 外源基因exogenousgene 利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。 3.4 阳性目标DNA对照positiveDNAtargetcontrol 参照DNA或从可溯源的标准物质提取的DNA或从含有已知序列阳性样品（或生物）中提取的 DNA。该对照用于证明测试样品的分析结果含有目标序列。 3.5 阴性目标DNA对照negativeDNAtargetcontrol 不含外源目标核酸序列的DNA片段。可使用可溯源的阴性标准物质。 3. 6 提取空白对照extractionblankcontrol 该对照为在DNA提取过程中，以水代替测试样品完成提取过程所有步骤，用以证明提取过程中没 1 SN/T1198-2013 有核酸污染。 以不同批次提取的DNA并进行多个PCR分析时，在做测试样品PCR时还应同时包括提取空白 对照。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AAD:resides outside T-DNA 在转座自大肠杆菌Tn7中编码链霉素腺苷酰（基)转移酶的基因 ArabSSU1A:arabidopsis thaliana ribulose-1'5-bisphosphate carboxylase(Rubisco)small subunit ats1Apromoter 拟南芥（Arabidopsisthaliana）的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基1A的启动子 CaMV35S:promoter from cauliflowermosaic virus 花椰菜花叶病毒35S启动子 CP4 EPSPS:5-enolpyrulshikimate-3-phosphate synthase 5-enolpyrul shikimate-3-phosphate syn- thase 来源于农杆菌Agrobacteriumsp.StrainCP4的5-葬草酸-3-磷酸合成酶 cry3A:cry3Adelta-endotoxin 由Bacillusthuringiensis subsp.Tenebrionis(B.T.T)strainBI256-82的蛋白。这个蛋白具有抗 虫活性，尤其是可以选择性杀死科罗拉多马铃薯甲虫（Coloradopotatobeetlelaruae） CTAB:hexadecyl trimethyl ammonium bromide 十六烷基三甲基溴化铵 E9 3':the 3 non-translated region of the pea ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit (rbeS)E9 gcne 来源于豌豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶E9基因小亚基3'端序列 EDTA: ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 FMV35S:apromoterderivedfromfigwortmosaicvirus 玄参花叶病毒35S启动子 NOS:nopaline synthase terminator 脂碱合成酶3'转录终止子 NPT-II:neomycin phosphotransferase-II 新霉素-3'-磷酸转移酶 oriV: resides outsideT-DNA 一个源自农杆菌Agrobacterium的RK2质粒的1.3kb的复制区域 ori332:resides outsideT-DNA 一个源自pBR322质粒的1.8kb的片段，其中包含复制区域和转移结合位点bom PLRVrep:potato leaf roll virus replicase 马铃薯卷叶病毒复制酶 PVYcp:potato Y virus coat protein 马铃薯Y病毒外壳蛋白 Tris;2-amino-2-(hydroxymcthyl)-1,3 propanediol 三羟甲基氨基甲烷 2 SN/T1198—2013 UGPase:UDP-glucosepyrophosphorylasc 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 5 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 6抽样与制样 6.1抽样 按照GB/T19495.7中规定的方法执行。 6.2制样 6.2.1马铃薯块茎、生薯条、生薯片、植株样品的制备 对于同一个批次的马铃薯块荃、生薯条、生薯片、植株样品，把每一个样品洗净，在任意部位用小刀 切下约1cm3的样品，用液氮研磨成粉末制成小样，然后将所有小样混匀，取1g用于提取DNA。 6.2.2马铃薯淀粉样品的制备 把每包取样的120g淀粉充分混合，从中取1g作为小样，然后将所有小样在一起充分混匀，取1g 用于提取DNA。 7普通PCR方法 7.1原理 样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术， 特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。 7.2试剂和材料 除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 7.2.1引物：检测转基因马铃薯的引物及其信息见附录A，并参见附录B。 7.2.2TaqDNA聚合酶。 7.2.3dNTPs:dATP、dTTP,dCTP,dGTP,dUTP。 7.2.43 琼脂糖：电泳纯。 7.2.5 溴化乙锭(EB)或其他染色剂。 7.2.6 三氯甲烷。 7.2.7 异戊醇。 7.2.8异丙醇。 7.2.9 70%乙醇。 7.2.10 分子量Marker：DL2000。 7.2.11 CTAB提取缓冲液（pH8.0)：称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTris，1.50gNazEDTA （乙二胺四乙酸钠盐），用适量水溶解后，调节pH到8.0，定容至200mL，高压灭菌备用。 7.2.12 CTAB沉淀缓冲液（pH8.0）：称取1.0gCTAB，0.50g氯化钠，用适量水溶解后，调节pH到 3 SN/T1198—2013 8.0，定容至200mL，高压灭菌备用。 7.2.13TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl,pH8.0;1mmol/LEDTA,pH8.0。 7.2.141.2mol/LNaCl溶液。 7.2.1510×PCR缓冲液：100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO..20mmol/LMgSO,.200mmol/L Tris-HCl(pH8.8),1%Triton X-100,1 mg/mL BSA。 7.2.16