SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3084.2—2014 进出口化妆品眼刺激性试验 第2部分：角膜细胞试验方法 Cosmetics eye irritation test- Part 2:Corncal cell line method 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3084.2—2014 前言 SN/T3084《进出口化妆品眼刺激性试验》分为2个部分： 第1部分：体外中性红吸收法； 第2部分：角膜细胞试验方法。 本部分为SN/T3084的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局，中华人民共和国广东出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：邱璐、李小林、王艳、程树军、蒋静、潘芳、刘俊平 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3084.2—2014 进出口化妆品眼刺激性试验 第2部分：角膜细胞试验方法 1范围 SN/T3084的本部分规定了化妆品眼刺激性角膜细胞试验方法。 本部分适用于化妆品原料和成品眼刺激性体外筛选试验。 本部分适用于部分化妆品使用的表面活性剂的筛选测试。 本部分可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一。可以结合其他眼刺激替代试验，对眼刺激效应 进行综合评价 本部分可作为其他领域眼刺激体外测试的参考方法。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2285化妆品体外替代试验实验室规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 眼刺激性eyeirritation 眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化 3.2 SIRC细胞系statens seruminstitut rabbit cornea cell line 来源于兔眼角膜组织的成纤维细胞系。 3.3 STE试验 shorttime exposuretest 4原理 本试验采用来源于眼刺激靶器官的SIRC细胞系，将样本干预细胞5min，然后去除。采用CCK-8 细胞毒性测试法（cellcountingkit-8cytotoxicitytest），使干预后的细胞与CCK-8试剂反应，活细胞线 粒体中的脱氢酶会将CCK-8试剂还原成橙黄色的甲染料，活细胞越多，被还原成的染料越多，颜色深 浅与细胞数目呈线性关系。通过测定波长450nm时的吸光度值，计算细胞的生存率，判断样品的眼刺 激性。本部分为STE短时暴露试验，适用于不同溶解性状的样本。 1 SN/T 3084.2—2014 5仪器与试剂耗材 5.1 仪器 5.1.1 ⅡI级生物安全柜。 5.1.2 二氧化碳培养箱：温度37℃±1℃，湿度90%±5%，5%±1%CO，浓度。 5.1.3 恒温水浴箱：温度37℃土1℃。 5.1.4 倒置显微镜。 5.1.5 酶标仪。 5.1.6 电子大平：0.1mg量程 5.1.7 细胞计数仪或血球计数器。 5.1.8 离心机。 5.1.9 混悬仪。 5.1.10 真空吸液泵。 5.1.11 程序降温仪。 5.1.12 液氮罐。 5.1.13 5μ~50μl10μ~100μL，20μ~200μ量程排枪。 5.1.14 细胞冻存盒。 5.2 试剂耗材 5.2.1 MEM培养基(minimum essential medium)。 5.2.2 胎牛血清（FBS)：56℃加热灭活30min。 5.2.3 0.25%胰酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA）：0.25%胰酶溶液与0.02mol/LEDTA溶液1：1混均。 5.2.4 青霉素/链霉素双抗：工作溶液青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）。 5.2.5 MEM完全培养基：含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。 5.2.6 二甲基亚砜（DMSO)。 5.2.7 细胞冻存培养基：含20%FBS、10%DMSO的MEM培养基。 5.2.8 磷酸盐缓冲液(PBS)。 5.2.9 矿物油：细胞培养级。 5.2.10 0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）：称取0.01gSDS.于10mL无菌试管中，加入PBS至10mL。 意服务平台 5.2.11 5%吐温20（TWEEN20）：称取0.5gTWEEN20手10mL无菌试管中，加人PBS至10mL。 5.2.12 CCK-8 试剂。 5.2.13 50mL无菌离心管。 5.2.14 无菌吸管（5mL，10mL）。 5.2.15 10mL无菌试管。 5.2.16 细胞培养瓶及培养板：25cm、75cm²培养瓶：96孔平底细胞培养板。 6试验方法 6.1 基本要求 试验过程应符合SN/T2285的要求。为保证溯源性，SIRC细胞应由有资质的细胞库提供，选择 2