ICS11.120.01 CCSC27 团 体 标 准 T/TPPA0007-2024 基于血小板活化生物标志物CD62p检测的 中药注射剂活血化瘀活性评价方法操作 规程 OperatingprocedureforevaluatingthepotentoftraditionalChinese medicineinjectionforpromotingbloodcirculationandremovingblood stasisbasedonactivatedplateletbiomarkertest 2024-05-31发布 2024-05-31实施 天津市医药行业协会发布 全国团体标准信息平台 T/TPPA0007-2024 目次 前言.............................................................................I 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4检测原理...........................................................................1 5材料与设备.........................................................................2 5.1材料...........................................................................2 5.2设备...........................................................................2 6实验方法...........................................................................2 6.1溶液配制.......................................................................2 6.2实验步骤.......................................................................2 7数据处理及判定.....................................................................4 全国团体标准信息平台 T/TPPA0007-2024 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由天津市药品检验研究院提出。 本文件由天津市医药行业协会归口。 本文件起草单位：天津市药品检验研究院、天津天士力之骄药业有限公司、现代中药创制全国重点 实验室、天津药物研究院有限公司、天津红日药业股份有限公司、津药达仁堂集团有限公司中药研究院、 天津宏仁堂药业有限公司、津药达仁堂集团股份有限公司乐仁堂制药厂。 本文件主要起草人：王冲、税凤春、徐琳、岳洪水、张铁军、田成旺、周学海、宋纹、张培元、华 晓东、杨天骄、贾文婷、刘萍、许浚、延阔、侯钰卓、张营、张慧、刘丽、聂晓洁、张俊华、何毅。 全国团体标准信息平台 T/TPPA0007-2024 1基于血小板活化生物标志物CD62p 检测的中药注射剂活血化瘀活性评价方法操作规程 1范围 本文件规定了以体外血小板活化生物标志物P-选择素（CD62p）评价中药注射剂活血化瘀活性的实 验方法。 本文件适用于以活化血小板为靶点的活血化瘀类中药注射剂的活性评价，对于作用于其他靶点如改 善血液流变学等的活血化瘀类中药注射剂不适用。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB14925实验动物环境及设施 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T24001环境管理体系要求及使用指南 GB/T45001职业健康安全管理体系要求及使用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物标志物biomarker 又称生物学标记或生物标志，指反映生物体系与外源化学物、物理和生物因素之间相互作用的任何 可测定的指标，包括化学、生化、生理、行为或其他的改变。 3.2 流式细胞术flowcytometry 系以流式细胞仪为工具，通过多种单克隆的抗体以及荧光染料，测定一个细胞的一种或多种参数， 用于判断细胞的属性和分化程度。 4检测原理 全国团体标准信息平台 T/TPPA0007-2024 2对血小板功能的影响是活血化瘀类中药临床功效的主要评价指标之一，《实用流式细胞术-血液病 篇》及大量临床研究实践表明，血小板膜糖蛋白P-选择素（CD62p）是临床上判定血小板活化程度及血 栓形成的特异性生物标志物，因此用CD62p作为生物标志物可以准确可靠的评价活血化瘀类中药注射剂 的活血化瘀作用。血小板活化后，CD62p表达上调，程度与血小板活化有很强的相关性。二磷酸腺苷（ADP） 为一种较为温和的血小板活化诱导剂，可适度活化血小板，引发后续血小板凝集、血瘀等反应。具有活 血化瘀功能的药物应能拮抗ADP作用，下调血小板CD62p表达，发挥活血化瘀作用。 本法系将一定量的供试品与大鼠抗凝血混合，作用一定时间后，以流式细胞术检测生物标志物的方 法测定经ADP激活的血小板活化率，并与供试品作用前进行比较，判定该供试品是否具有活血化瘀作用。 5材料与设备 5.1材料 5.1.1实验动物 大鼠，SD或Wistar，8只，体重250g～350g，雌雄各半，雌鼠应无孕。实验动物应从取得实验动 物生产许可证资质的单位购进。在实验期间应按国家对实验动物饲养条件要求进行饲养。动物饲养符合 GB14925和GB/T24001的要求，动物实验符合GB19489和GB/T45001的要求。 5.1.2试剂试药 a）anti-mouse/ratCD62pPE-Cy7、Anti-Mouse/RatCD61PE、RatIgG2aPE-Cy7、RatIgG1PE。 b）ADP、3.8%枸橼酸钠、4%多聚甲醛（固定液）、缓冲液、补偿微球、PBS（pH7.2～7.4）。 5.2设备 流式细胞仪。 6实验方法 6.1溶液配制 除另有规定外，按各品种项下规定的浓度配制成所需浓度的供试品溶液备用。 6.1.120µMADP溶液的配制 精密称定ADP适量，加入0.9%氯化钠注射液配成浓度为20µM的溶液备用。配制后可分装，-20℃冻 存，7天内使用。不可反复冻融。 6.1.23.8%枸橼酸钠溶液的配制 称定枸橼酸钠适量，用纯化水配成3.8%的枸橼酸钠溶液备用，如无浑浊等异常可在3个月内使用。 6.2实验步骤 全国团体标准信息平台 T/TPPA0007-2024 36.2.1抗凝血的采集 大鼠8只，雌雄各半，乙醚轻麻醉后，采用玻璃毛细管眼眶取血500µL～1000µL，分别置于采血 管中(按9:1的比例预加入3.8%枸橼酸钠抗凝)，轻轻混匀，备用。采血前动物应禁食16h～24h。 6.2.2抗凝血的分组 将每只动物采集的抗凝血分成3份，每份50µL，一份为空白血样，一份为基础血样，一份为加药 血样。 6.2.3血样的制备 空白血样的制备：取抗凝血50µL，加入0.9%氯化钠注射液50µL，轻轻摇匀，37℃±1℃作用 5min，作为空白血样备用。 基础血样的制备：另取抗凝血50µL，加入0.9%氯化钠注射液50µL，轻轻摇匀，37℃±1℃作用 5min，作为基础血样备用。 加药血样的制备：另取抗凝血50µL，加入适宜浓度供试品溶液50µL，轻轻摇匀，37℃±1℃作 用适宜时间，作为加药血样备用。 ADP激活血样的制备：分别取上述基础血样和加药血样，各加入100µL浓度为20µM的ADP激活，使 得ADP的终浓度为10µM，涡旋混匀1s，反应2min。 6.2.4抗体标记 a）血小板的标记取上述各组血样，分别加入抗体CD62pPE-Cy7和CD61PE各1.0µL～2.0µL双标， 以CD61标记所有血小板，以CD62p标记活化血小板。 b）同型对照为证明上述抗体的结合具有特异性，应设置同型对照管。另取抗凝血50µL，同体积 20µM的ADP激活，再加入IgG2aPE-Cy7和IgG1PE各1.0µL～2.0µL标记，作为同型对照管。 c）CD61PE单标另取任意空白血样一份，同体积ADP激活后，只加入抗体CD61PE各1.0µL～2.0µL 标记。 6.2.5孵育 上述各血样加入不同抗体后，4℃±1℃避光孵育20min。 6.2.6固定 各管孵育结束后加入固定液0.5mL，固定10min～20min，4℃±1℃，避光。 6.2.7稀释