ICS 65.020 CCS A 031 T/NAIA 团 体 标 准 T/ NAIA 0402-2025 牛乳头瘤病诊断技术规程 Technical protocol for the diagnosis of bovine papillomatosis 2025-08-28发布 2025-09-01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布 全国团体标准信息平台 I前  言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏农林科学院动物科学研究所、 同心县科技服务中心、 平罗县农业农村局、固原 市畜牧技术推广服务中心 、原州区动物疾病预防控制中心 、银川市畜牧技术推广服务中心 、隆德县动物疾 病预防控制中心。 本文件主要起草人 ：郭亚男、张俊丽、 王鑫、陈建银、郭建平、李矞、 马科、杨国武、 牛晓昊、 谢建 亮、王嘉凡、张久盘、王小龙 、曹晓真、岳康、慕彦彤、刘岩峰、康晓梅、李彦强。 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0402-2025 1牛乳头瘤病诊断技术规程 1 范围 本文件规定了牛乳头瘤病诊断技术的术语和定义 、牛乳头瘤病临床诊断 、样品采集及保存 、分子生物 学诊断、病理组织学观察。 本文件适用于牛养殖户、规模化牛场对牛乳头瘤病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用本文件 ；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 T/WHAS 030-2022 常规病理标本 HE制片染色规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛乳头状瘤 Bovine Papillomas 由牛乳头瘤病毒（ Bovine Papillomavirus, BPV）引起的一种常见疾病，主要影响牛的皮肤和黏膜，导 致良性肿瘤的形成。 4 诊断 4.1 临床症状 牛乳头状瘤主要集中在患病牛的头部 ，另外颈部 、胸腹部等皮肤部均有乳头状瘤发生 ，颜色多呈灰白 色或褐色 。瘤体表面粗糙呈菜花状 、结节状外观 ，质地较为坚硬 ，容易破溃出血 ，切开瘤体后有乌黑色污 浊液体从瘤体中央流出。通常几个瘤在一起生长，有时连成一片 ，瘤体直径约 0.5cm～8 cm。 4.2 样品采集及保存 采集牛血液或 采用 75 %医用酒精对瘤体及外周进行消毒 ，然后采用外科手术摘除感染牛皮肤表面瘤体 ， 采集的乳头状瘤样本放在 50 %甘油生理盐水溶液中，低温保存运输送至实验室保存。 4.3 病理组织学观察 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0402-2025 2若病理组织切片中出现以下现象则可确诊为 乳头状瘤 ：角质层增厚， 局部可见角化不全 ；表皮层棘层 肥厚，皮突延长，表皮上部多见上皮细胞胞质空泡化，局部可见上皮细胞点状坏死， 核碎裂或溶解 ；真皮 层可见少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部可见毛细血管扩张。 5 分子生物学诊断 5.1 引物合成 基于 NCBI上公布的乳头状瘤病毒 L1基因序列， 由生物公司合成引物 P1: P1：5'-ATGGCGTTGTGGCAACAAG-3' ，P2：5'-TTAAGCTTTGATTTTTTTTC-3' ，产物长度 1494bp。 5.2 DNA的提取方法 将样品置于超净工作台中室温解冻， 取200 mg的动物组织加入约 3倍体积的生理盐水进行匀浆，充 分匀浆后 10 000 r/min离心 2 min去除残余组织 。取300 μl上清液至新的洁净离心管中 。然后参照 “血液 /细 胞/组织 DNA提取试剂盒 ”说明书操作提取乳头样肿瘤组织基因组 DNA,于-20 ℃ 保存备用。 5.3 PCR扩增 采用合成引物对 DNA组进行扩增， 反应体系为 50 μL体系：DNA模板 2 μL，上下游引物各 1 μL（20 μmol/L）， 2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。引物反应条件为：预变性 95 ℃ 2 min；变性 95 ℃ 30 s，退火 53 ℃ 20 s，延伸 72 ℃ 2 min，30个循环； 72 ℃终延伸 8 min。 5.4 PCR产物测序 按照上述程序对样品 DNA提取物进行 PCR扩增，产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳分析后，用凝胶回收试 剂盒纯化回收 PCR产物，将PCR纯化产物送生物公司测序。 5.5 PCR产物序列比对及分子进化分析 扩增序列遗传进化分析采用 SeqMan Pro软件对扩增产物测序结果进行拼接， 然后通过 NCBI网站的 BLAST程序进行相似性比对； 将对比的序列从 NCBI下载并整理后采用 MEGA软件中的邻接法构建系统 进化树，进行遗传进化分析。 5.6 结果判定 在阳性对照出现相应扩增带 、阴性对照无此扩增带时判定结果 。出现预期大小的扩增片段时 ,判定为检 测阳性 ,否则判定为阴性。若为阳性，则需进一步测序比对，通过比对结果， 验证 PCR产物的正确性。最 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0402-2025 3后进行遗传进化分析，获取毒株之间亲缘关系。 _________________________________ 全国团体标准信息平台