5

$*'45
 N *8.OFF8O 1." - R1$3" *$4
 $$4
9
 N . 

  -  -    -  -   &YBNJOBUJPO
PG
NJDSPCJBM
GPPE
DVMUVSF  %FUFDUJPO
PG
Lacticaseibacillus paracasei
1." - R1$3
NFUIPE全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。 本文件起草单位:中国食品发酵工业研究院有限公司、国家食品安全风险评估中心、汤臣倍健股份有 限公司、发酵行业生产力促进中心、内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司、上海上药信谊微生态科技有限 公司、深圳保时健生物工程有限公司。 本文件主要起草人:姚粟、郭立峥、徐进、迮晓雷、王岗、宋程羽、葛媛媛、宋智泉、杨静、张晓娜、蔡顺 风、张思璐。 ⅠT/CIFST 029—2025 全国团体标准信息平台 食品用菌种检验 副干酪乳酪杆菌检验 PMA-qPCR法 1 范围 本文件规定了食品中副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)的PMA-qPCR检验方法。 本文件适用于食品原料和固体饮料中副干酪乳酪杆菌的活菌定量检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB 4789.35—2023 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光定量PCR quantitative real-time polymerase chain reaction 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,并通过标准曲 线对未知模板进行定量分析的方法。 3.1.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CFU:菌落形成单位(colony forming unit) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) LED:发光二极管(light emitting diode) McF:麦氏浊度单位(McFarland) OD:光密度(optical density) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PMA:叠氮溴化丙锭(propidium monoazide) qPCR:实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) 1T/CIFST 029—2025 全国团体标准信息平台 ROX:一种荧光染料(carboxy-X-rhodmine) 4 原理 PMA是一种具有DNA高亲和力的光反应染料,在强可见光下可与待测样本中死菌或者游离双链 DNA形成共价连接,从而阻止死菌或者游离DNA的后续PCR扩增。样品经PMA染料处理、DNA提 取后,采用副干酪乳酪杆菌特异性引物进行qPCR扩增。细胞膜结构完整的活菌菌体DNA在qPCR扩 增反应中能够产生荧光信号。当扩增产物的荧光信号达到设定阈值时,可被实时检测并生成Ct值,将 Ct值代入标准曲线方程中,计算获得样品中副干酪乳酪杆菌的活菌数量。 5 仪器设备 5.1 实时荧光定量PCR仪。 5.2 高速台式冷冻离心机:0~20 000 r/min。 5.3 酶标仪。 5.4 麦氏比浊仪。 5.5 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 5.6 生物安全柜或超净工作台。 5.7 冰箱:2 ℃~8 ℃、-30 ℃~-20 ℃。 5.8 涡旋振荡仪。 5.9 LED光解仪:最大功率60 W,频率50 Hz~60 Hz,LED输出波长465 nm~475 nm。 5.10 珠式样品研磨器:速度0.8 m/s~8 m/s。 5.11 拍打式均质器。 5.12 高压灭菌锅。 5.13 天平:感量0.01 g。 5.14 微量可调移液器及配套吸头:0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1 000 μL。 6 试剂或材料 除特别说明外,仅使用分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T 6682中一级水。 6.1 无菌均质袋。 6.2 无菌离心管:1.5 mL。 6.3 无菌玻璃珠:粒径0.1 mm。 6.4 无菌研磨管:2 mL。 6.5 荧光定量PCR 8连排管或96孔板。 6.6 96孔细胞培养板。 6.7 麦氏比浊管。 6.8 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基:见GB 4789.35—2023附录A中A.2。 6.9 PMA溶液:浓度20 mmol/L。 6.10 无菌超纯水。 6.11 0.85%无菌生理盐水:见GB 4789.35—2023附录A中A.8。 6.12 实时荧光定量PCR混合试剂。 6.13 ROX参比染料(50×)。 2T/CIFST 029—2025 全国团体标准信息平台 6.14 阳性对照:副干酪乳酪杆菌CICC 6263T或等效菌株的DNA,或扩增片段的阳性克隆分子DNA。 6.15 阴性对照:非副干酪乳酪杆菌的DNA,如植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CICC 6009的DNA。 7 检验程序 副干酪乳酪杆菌PMA-qPCR法检验程序见图1。 3@0 
HUN-U
N-/F" A 0%  7US!!".D'7_ U8F3 
$'6N-U  1.") U1."3"
μ NPM-U5
NJOU&
NJOU  %/" UF*) -.U
NT--E--
T_
TU 8F1$3 U/U


TU


TU


TUK8 UUE=(U.FF8 7.34)6  

d


Id
I "3 
$'6N-+8"  1.")  %/"U E=/F(#
 8 "U"" 8 8F1$3 3 3=E 图1 副干酪乳酪杆菌PMA-qPCR法检验程序 8 检验步骤 8.1 样品制备及前处理 8.1.1 按照GB 4789.35—2023中6.1规定的方法将待检测样品制备成1∶10的样品匀液。 8.1.2 采用微量可调移液器,以无菌操作吸取8.1.1制备的1∶10样品匀液200 μL注入96孔细胞培 养板中,利用酶标仪测定样品OD620值。将1∶10样品匀液调整至OD620值为0.3~0.5时,总菌体数量 约为108 CFU/mL。或者以无菌操作吸取8.1.1制备的1∶10样品匀液3 mL注入麦氏比浊管中,利用 麦氏比浊仪将样品匀液调整至McF值为1.0~3.0,总菌体数量约为108 CFU/mL。 8.1.3 吸取108 CFU/mL样品匀液500 μL,注于1.5 mL无菌离心管中。 8.2 样品PMA处理 8.2.1 在避光条件下,以无菌操作吸取PMA溶液1.25 μL,注于8.1.3的无菌离心管中,颠倒混匀至少 10次,制成PMA终浓度为50 μmol/L的样品溶液。 8.2.2 将样品溶液置于暗处,室温孵育5 min,每隔1 min颠倒混匀一次。 3T/CIFST 029—2025 全国团体标准信息平台 8.2.3 将样品溶液置于LED光解仪内,曝光照射15 min,曝光结束后于室温下12 000 r/min离心 15 min,弃上清液。 8.3 样品DNA模板制备 8.3.1 吸取无菌超纯水200 μL,注于8.2.3的离心管中,反复吹吸使其混匀。 8.3.2 吸取8.3.1离心管中的全部菌液,注于装有0.25 g无菌玻璃珠的2 mL无菌研磨管中。 8.3.3 将无菌研磨管置于珠式样品研磨器中,以6 m/s破碎速度破碎10 s~15 s。于室温下12 000 r/min 离心15 min,获得DNA粗提液。取50 μL上清液,注于1.5 mL无菌离心管中。将提取后的DNA模板 置于2 ℃~8 ℃立即使用,否则应于-20 ℃以下保存,并于1周内使用。 8.4 实时荧光定量PCR扩增 8.4.1 实时荧光定量PCR反应体系 实时荧光定量PCR反应体系总体积为20 μ