2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 淡 水 池 塘 底 质 微 生 物 菌 群 结 构 多 样 性 测 定 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 9 4 5 1 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f t h e d i v e r s i t y o f m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e i n t h e s e d i m e n t o f f r e s h w a t e r p o n d s b y d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s m e t h o d S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T９４５１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会渔业资源分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１０)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心、上海海洋大学、全国水产技术推广总站. 本文件主要起草人:孙盛明、戈贤平、胡红浪、朱健、张成锋. ⅠSC/T９４５１—２０２５ 淡水池塘底质微生物菌群结构多样性测定　变性梯度凝胶电泳法 １　范围 本文件描述了用变性梯度凝胶电泳法测定淡水养殖池塘底质微生物菌群结构多样性的原理、试剂和 材料、仪器设备、样品、试验步骤、数据处理. 本文件适用于淡水养殖池塘的底泥微生物菌群结构多样性检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和实验方法 GB/T２４７６９　工业用丙烯酰胺 GB/T３２７２５　实验室测定微生物过程、生物量与多样性用土壤的好氧采集、处理及贮存指南 SC/T９１０２􀆰３　渔业生态环境监测规范　第３部分:淡水 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 变性梯度凝胶电泳denaturedgradientgelelectrophoresis,DGGE 根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统. ４　原理 首先提取样品总DNA,再利用PCR扩增DNA样品中的１６SrDNA基因片段.扩增的DNA片段通 过变性处理,使其变性梯度凝胶电泳分离.已经扩增和变性的DNA样品通过电泳在凝胶中移动并形成 DNA条带.对变性梯度凝胶进行染色和可视化,可以观察到不同的DNA条带,每个DNA条带代表一个 具有特定DNA序列的微生物.通过比较不同样品中的DNA条带,可以推断微生物群落的差异和结构. ５　试剂和材料 警示———丙烯酰胺具有神经毒性,按照GB/T２４７６９规定的注意事项和保存事项操作. 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯及以上的试剂,以及符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　氯化钠(NaCl). ５􀆰１􀆰２　丙烯酰胺(C３H５NO). ５􀆰１􀆰３　双丙烯酰胺(C７H１０N２O２). ５􀆰１􀆰４　蛋白酶K(C７H１４O). ５􀆰１􀆰５　氢氧化钠(NaOH). ５􀆰１􀆰６　过硫酸铵(H８N２O８S２). ５􀆰１􀆰７　十二烷基硫酸钠(SDS). ５􀆰１􀆰８　尿素(CH４N２O). １SC/T９４５１—２０２５ ５􀆰１􀆰９　硝酸银(AgNO３). ５􀆰１􀆰１０　十六烷基三甲基溴化铵(CTAB). ５􀆰１􀆰１１　三羟甲基氨基甲烷(Tris). ５􀆰１􀆰１２　乙二胺四乙酸(EDTA). ５􀆰１􀆰１３　琼脂糖:电泳级. ５􀆰１􀆰１４　氯仿(CHCl３). ５􀆰１􀆰１５　异戊醇(C５H１２O). ５􀆰１􀆰１６　异丙醇(C３H８O). ５􀆰１􀆰１７　乙酸(C２H４O２). ５􀆰１􀆰１８　乙醇(C２H６O). ５􀆰１􀆰１９　四甲基乙二胺(TEMED). ５􀆰１􀆰２０　甲酰胺(CH３NO):去离子. ５􀆰１􀆰２１　福尔马林:含３７％~４０％甲醛. ５􀆰１􀆰２２　盐酸(HCl):优级纯,浓度３６％. ５􀆰１􀆰２３　脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP):２􀆰５mmol/L. ５􀆰２　材料 ５􀆰２􀆰１　TrisＧHCl:称取１２１g三羟甲基氨基甲烷(５􀆰１􀆰１１),加８００mL水溶解后,用盐酸(５􀆰１􀆰２２)调节溶 液pH至８􀆰０,加水定容至１L. ５􀆰２􀆰２　EDTA溶液:称取３７２􀆰２g乙二胺四乙酸(５􀆰１􀆰１２),加约８００mL水溶解后,用盐酸(５􀆰１􀆰２２)调节 溶液pH至８􀆰０,加水定容至１L. ５􀆰２􀆰３　DNA抽提缓冲液:分别称取１２􀆰１１g三羟甲基氨基甲烷(５􀆰１􀆰１１)、７g氯化钠(５􀆰１􀆰１)、７􀆰４６４g乙 二胺四乙酸(５􀆰１􀆰１２)和２０g十六烷基三甲基溴化铵(５􀆰１􀆰１０),加约９００mL水,用盐酸(５􀆰１􀆰２２)调节溶液 pH至８􀆰０,加水定容至１L. ５􀆰２􀆰４　蛋白酶K溶液:称取０􀆰２g蛋白酶K(５􀆰１􀆰４),溶于１０mL水中,储存于－２０℃下备用. ５􀆰２􀆰５　１０％SDS:称取１００g十二烷基硫酸钠(５􀆰１􀆰７)缓慢加入含有０􀆰９L水的烧杯中,搅拌直至完全溶 解,加水定容至１L. ５􀆰２􀆰６　氯仿异戊醇(１∶２４):在通风橱中,量取２４０mL异戊醇(５􀆰１􀆰１５)缓慢加入１０mL氯仿(５􀆰１􀆰１４) 中,混匀. ５􀆰２􀆰７　７５％乙醇溶液:量取７５０mL乙醇(５􀆰１􀆰１８)缓慢加入２００mL水中,摇匀,加水定容至１L. ５􀆰２􀆰８　TE缓冲液:分别吸取１０mLTrisＧHCl(５􀆰２􀆰１)和１mL１mol/LEDTA溶液(５􀆰２􀆰２)混合均匀. ５􀆰２􀆰９　５０×TAE缓冲液:分别称取２４２g三羟甲基氨基甲烷(５􀆰１􀆰１１)和３７􀆰２g乙二胺四乙酸(５􀆰１􀆰１２), 吸取５７􀆰１mL乙酸(５􀆰１􀆰１７),加水溶解并定容至１L,现用现配. ５􀆰２􀆰１０　１×TAE缓冲液:吸取２０mL５０×TAE缓冲液(５􀆰２􀆰９),加９８０mL水稀释,现用现配. ５􀆰２􀆰１１　１％琼脂糖凝胶:称量１g琼脂糖(５􀆰１􀆰１３)于锥形瓶中,加入１００mL１×TAE缓冲液(５􀆰２􀆰１０), 轻摇混匀后微波炉中火加热至沸腾,取出摇匀. ５􀆰２􀆰１２　４０％丙烯酰胺溶液:称取３８􀆰９３g丙烯酰胺(５􀆰１􀆰２),１􀆰０７g双丙烯酰胺(５􀆰１􀆰３)于１００mL棕色 容量瓶中,加水至６０mL,加热溶解,加水定容至１００mL. ５􀆰２􀆰１３　１０％过硫酸铵溶液:称取１g过硫酸铵(５􀆰１􀆰６),加水溶解并定容至１０mL,现用现配. ５􀆰２􀆰１４　３５％变性梯度凝胶:称取２􀆰９４g尿素,分别吸取４mL４０％丙烯酰胺溶液(５􀆰２􀆰１２)、０􀆰４mL ５０×TAE缓冲液(５􀆰２􀆰９)、２􀆰８mL甲酰胺(５􀆰１􀆰２０)、１２０μL１０％过硫酸铵溶液(５􀆰２􀆰１３)和１０μL四甲基 乙二胺(５􀆰１􀆰１９),混合均匀,加水至２０mL. ５􀆰２􀆰１５　５５％变性梯度凝胶:称取４􀆰６２g尿素,分别吸取４mL４０％丙烯酰胺溶液(５􀆰２􀆰１２)、０􀆰４mL ２SC/T９４５１—２０２５ ５０×TAE缓冲液(５􀆰２􀆰９)、４􀆰４mL甲酰胺(５􀆰１􀆰２０)、１２０μL１０％过硫酸铵溶液(５􀆰２􀆰１３)和１０μL四甲基 乙二胺(５􀆰１􀆰１９),混合均匀,加水至２０mL. ５􀆰２􀆰１６　固定液:分别吸取５０mL乙醇(５􀆰１􀆰１８)和２􀆰５mL乙酸(５􀆰１􀆰１７),均匀混合,加水定容至５００mL. ５􀆰２􀆰１７　银染液:称取１g硝酸银(５􀆰１􀆰９),吸取０􀆰７５mL福尔马林(５􀆰１􀆰２１),均匀混合,加水定容至５００mL. ５􀆰２􀆰１８　显色液:称取７􀆰５g氢氧化钠(５􀆰１􀆰５),吸取２􀆰５mL福尔马林(５􀆰１􀆰２１),均匀混合,加水定容至５００mL. ５􀆰２􀆰１９　终止液:分别吸取５０mL乙醇(５􀆰１􀆰１７)和２􀆰５mL乙酸(５􀆰１􀆰１７),均匀混合,加水定容至 ５００mL. ６　仪器设备 ６􀆰１　变性梯度凝胶电泳仪. ６􀆰２　恒温摇床. ６􀆰３　天平:感量０􀆰００１g ６􀆰４　凝胶成像分析仪. ６􀆰５　梯度PCR仪. ６􀆰６　低温离心机:最低温度不高于４℃,转速不低于１２０００r/min. ６􀆰７　网筛:５mm网孔. ６􀆰８　微波炉. ６􀆰９　冰箱:－２０℃. ６􀆰１０　高压灭菌锅. ６􀆰１１　恒温水浴锅. ６􀆰１２　涡旋振荡器. ７　样品 ７􀆰１　按照SC/T９１０２􀆰３规定的方法采集池塘底泥样品,在池塘四角和中央５个区域的上层(０cm~１０cm)、 中层(１０cm~２０cm)、下层(２０cm~３０cm)、底层(３０cm~４０cm)底泥分别取样.单次取样不少于 ２００g.采集的样品于无菌容器中保存. ７􀆰２　在超净工作台中,按照GB/T３２７２５中的方法对样品进行预处理:首先除去样品中的植物、可见动物 和石粒等杂物.将底泥在潮湿状态下过５mm筛网.过筛时缓慢翻