2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 斜 管 虫 病 诊 断 方 法 第 2 部 分 ： 鱼 斜 管 虫 病 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 4 8 . 2 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r c h i l o d o n e l l i a s i s — P a r t 2 : D i s e a s e c a u s e d b y p a r a s i t i c c i l i a t e C h i l o d o n e l l a p i s c i c o l a S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４８􀆰２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件为SC/T７２４８«斜管虫病诊断方法»的第２部分.SC/T７２４８已经发布了以下部分: ———第１部分:十六线斜管虫病; ———第２部分:鱼斜管虫病. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站、西华师范大学、水利部中国科 学院水工程生态研究所. 本文件主要起草人:李明、王桂堂、李文祥、张翔、梁艳、邹红、步夏莲、曾燏、王崇. ⅠSC/T７２４８􀆰２—２０２５ 引　　言 斜管虫病是淡水养殖中危害最严重的寄生虫病之一;可导致养殖鱼类在短期内大批死亡,造成巨大的 经济损失.SC/T７２４８«斜管虫病诊断方法»旨在建立一套准确、快速、易于操作的斜管虫病诊断方法.斜 管虫病主要有３种病原:十六线斜管虫、鱼斜管虫和钩刺斜管虫.由于这３种病原的生物学特征、易感宿 主、流行特点存在差异,因此斜管虫病诊断方法标准拟由３个部分构成. ———第１部分:十六线斜管虫病.目的在于确定进行十六线斜管虫病诊断的技术要求、诊断结果的判 定方法. ———第２部分:鱼斜管虫病.目的在于确定进行鱼斜管虫病诊断的技术要求、诊断结果的判定方法. ———第３部分:钩刺斜管虫病.目的在于确定进行钩刺斜管虫病诊断的技术要求、诊断结果的判定 方法. SC/T７２４８«斜管虫病诊断方法»通过３个部分明确了十六线斜管虫病、鱼斜管虫病和钩刺斜管虫病 的诊断方法.通过确定试验设备、试验方法和试验结果的处理,让检测人员能够更加清晰、准确地进行操 作,有效提升检测人员对斜管虫病的诊断能力,指导斜管虫病的准确诊断以及鱼种放养前的检验检疫,并 及时采取有效的防控手段,控制该寄生虫病的发生,减少水产养殖的经济损失.对于斜管虫病的流行病学 调查、诊断、检疫和监测具有重要意义,为水产养殖业的产业升级提供技术支撑. ⅡSC/T７２４８􀆰２—２０２５ 斜管虫病诊断方法 第２部分:鱼斜管虫病 １　范围 本文件描述了鱼斜管虫病诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品,以及形态学鉴定、PCR检测 和综合判定的方法. 本文件适用于鱼斜管虫病的流行病学调查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 寄生虫　parasite 寄生于水生动物的动物,包括原虫、蠕虫和甲壳类等. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰２] ３􀆰２ 寄生虫病　parasitosis 寄生虫侵入水生动物而引起的疾病. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰３] ３􀆰３ 鱼斜管虫　Chilodonellapiscicola 引起鱼类鱼斜管虫病的病原. ３􀆰４ 斜管虫病　chilodonelliasis 由斜管虫侵入鱼体而引起的寄生虫病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) TAE:TrisＧAcetateＧEDTA缓冲溶液 Taq:水生嗜热菌(Thermusaquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris􀅰HCl) １SC/T７２４８􀆰２—２０２５ Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) ５　试剂和材料 ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２中规定的一级水. ５􀆰２　无水乙醇:分析纯. ５􀆰３　异丙醇:分析纯. ５􀆰４　TaqDNA聚合酶:－２０℃保存,避免反复冻融. ５􀆰５　dNTPs(１０mmol/L):含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各１０mmol/L. ５􀆰６　矿物油. ５􀆰７　１％硝酸银溶液:按附录A中A􀆰１的要求配制. ５􀆰８　裂解缓冲液:按A􀆰２的要求配制. ５􀆰９　５０×TAE电泳缓冲液:按A􀆰３的要求配制. ５􀆰１０　１×TAE电泳缓冲液:按A􀆰４的要求配制. ５􀆰１１　DNA抽提缓冲液１:按A􀆰５的要求配制. ５􀆰１２　DNA抽提缓冲液２:按A􀆰６的要求配制. ５􀆰１３　５mol/LNaCl溶液:按A􀆰７的要求配制. ５􀆰１４　TE缓冲液:按A􀆰８的要求配制. ５􀆰１５　１％琼脂糖凝胶:按A􀆰９的要求配制. ５􀆰１６　上游引物:５′ＧAACCTGGTTGATCCTGCCAGTＧ３′; 下游引物:５′ＧTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACＧ３′. ５􀆰１７　DNAmarker. ５􀆰１８　核酸染料. ５􀆰１９　阳性对照:鱼斜管虫DNA模板,－２０℃保存. ５􀆰２０　阴性对照:无斜管虫DNA模板,－２０℃保存. ５􀆰２１　吸管. ５􀆰２２　盖玻片. ５􀆰２３　载玻片. ５􀆰２４　培养皿. ５􀆰２５　离心管. ６　仪器设备 ６􀆰１　体式显微镜. ６􀆰２　普通光学显微镜. ６􀆰３　天平:感量０􀆰００１g. ６􀆰４　紫外灯. ６􀆰５　水浴锅或金属浴. ６􀆰６　高速冷冻离心机:４℃转速１２０００g以上. ６􀆰７　普通冰箱:具４℃冷藏室和－２０℃冷冻室. ６􀆰８　微量移液器. ６􀆰９　PCR扩增仪. ６􀆰１０　水平电泳系统. ２SC/T７２４８􀆰２—２０２５ ６􀆰１１　凝胶成像系统. ７　临床症状 少量感染斜管虫的鱼体症状不明显.大量感染时,病鱼体瘦发黑、厌食,身体无法保持平衡、漂浮水面 或聚集在水体下风口;患病鱼体表常分泌大量黏液,皮肤溃烂,鱼鳃缺损坏死. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 优先采集具有典型临床症状的鱼. ８􀆰２　采样数量 每一采样批次取１０尾~２０尾.采样数量应符合SC/T７１０３中的规定. ８􀆰３　采样部位 鱼苗取整条鱼;鱼种或成鱼取鳃丝、鳍条,刮取体表黏液. ８􀆰４　样品运输 取样应加贴标签,标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点.样品运输应符合SC/T７１０３中的 规定. ８􀆰５　样品固定与保存 在体视显微镜下(放大４０倍)用吸管吸取虫体,部分样品制作水浸片,普通光学显微镜检查.部分样 品置于培养皿中,用水清洗后移至洁净的载玻片上,尽量吸去水分并在空气中干燥,制成干片,用于硝酸银 染色和后续形态学参数测量.用于PCR检测的虫体样品用水清洗干净后可直接加入无水乙醇固定,４℃ 保存备用. ９　形态学鉴定 ９􀆰１　水浸片观察 吸取虫体置于载玻片上,轻轻盖上盖玻片,置于普通光学显微镜下进行活体观察. ９􀆰２　硝酸银染色与形态学参数测量 用１％硝酸银溶液(５􀆰７)覆盖虫体干片样品,置于黑暗处染色１min.用水清洗后,自然晾干;置于紫 外灯下照射１０s~２０s显影.将染色样本置于显微镜下,测量虫体体长、体宽、左右体动基列数目等形态 学数据. ９􀆰３　形态学特征 鱼斜管虫的形态特征见附录B中的图B􀆰１和图B􀆰２. 活体形态:呈椭圆形壳状,腹侧扁平,背侧拱形,前部略向左侧突出;游动方式为自转或水平翻动. 虫体大小:长３０μm~８０μm,宽２０μm~４０μm. 腹面体动基列:分左右两组,左侧体动基列９列~１５列,右侧体动基列８列~１３列.最左侧的动基列 明显短于其他动基列. 胞核:大核呈椭圆形,位于虫体中部. 胞口:位于腹面前端,外有内外两圈围口动基列交错环绕.外侧的围口动基列明显长于内侧的围口动 基列.口前动基列始于胞口右上方,向左一直延伸至左、右体动基列的交界处. 胞咽:由９个~１０个刺杆组成. 其他特征:背端动基列片段呈线性,由１６个~１９个动基体组成. ９􀆰４　结果判定 如果虫体的形态学特征符合９􀆰３的描述,判定形态学鉴定结果为阳性. １０　PCR检测 １０􀆰１　DNA的提取 ３SC/T７２４８􀆰２—２０２５