2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 赤 羽 病 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 4 9 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a k a b a n e d i s e a s e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 4 9 — 2 0 0 2NY/T５４９—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 引言 Ⅲ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　生物安全措施 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　临床诊断 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　样品采集、处理与运输 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　病毒分离鉴定 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　RTＧPCR检测 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　实时荧光RTＧPCR检测 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　琼脂免疫扩散试验 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １２　微量血清中和试验 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １３　阻断酶联免疫吸附试验 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １４　综合判定 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　常用溶液配制 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　RTＧPCR试验相关溶液配制 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　RTＧPCR引物序列及荧光RTＧPCR引物和探针序列信息 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(规范性)　AKAV灭活抗原、标准阳性血清及标准阴性血清制备方法 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　琼脂免疫扩散试验结果判定示例 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(规范性)　阻断酶联免疫吸附试验相关溶液配制 １６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T５４９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T５４９—２００２«赤羽病细胞微量中和试验方法»,与NY/T５４９—２００２相比,除结构调 整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了临床诊断(见第６章); b)增加了样品采集、处理与运输(见第７章); c)增加了病毒分离鉴定(见第８章); d)增加了RTＧPCR试验(见第９章); e)增加了实时荧光RTＧPCR试验(见第１０章); f)增加了琼脂免疫扩散试验(见第１１章); g)增加了阻断酶联免疫吸附试验(见第１３章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:青岛海关技术中心、中国动物卫生与流行病学中心、烟台海关技术中心、南京农业大 学、昆明海关技术中心、艾迪威(青岛)生物科技有限公司、天津海关技术中心、郑州国际旅行卫生保健中 心、贵州省畜牧兽医研究所. 本文件主要起草人:孙涛、李超、尹伟力、李阳、邹海涛、艾军、何辉、吴发兴、肖妍、徐超、房保海、余波、 徐天刚、左媛媛. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５４９—２００２; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T５４９—２０２５ 引　　言 赤羽病是由赤羽病病毒(akabanevirus,AKAV)引起的牛、绵羊、山羊的一种非接触性传染的病毒性 疾病,主要以怀孕母畜繁殖障碍(流产、早产、死产、胎儿畸形、木乃伊胎等),以及新生动物关节弯曲和积水 性无脑症为特征.赤羽病病毒属于布尼亚病毒科正布尼亚病毒属,主要通过蚊子和库蠓等媒介昆虫传播, 也可通过垂直传播.该病于１９４９年在日本群马县赤羽村发生而得名.本文件的实施将提高我国赤羽病 的诊断和监测水平,以便及时采取防控措施,为保护家畜健康和产业发展起到重要作用. 本文件的制定参考了世界动物卫生组织«陆生动物诊断试验和疫苗标准手册»(２０２２年英文版),并结 合了我国相关技术研究新成果. ⅢNY/T５４９—２０２５ 　 　 　赤羽病诊断技术 １　范围 本文件规定了赤羽病的临床诊断、样品采集与处理、病毒分离鉴定、RTＧPCR方法、实时荧光RTＧPCR 方法、微量血清中和试验、阻断酶联免疫吸附试验、琼脂免疫扩散试验等方法的技术要求. 本文件适用于牛、绵羊和山羊赤羽病的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件. GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. AKAV:赤羽病病毒(akabanevirus) BHKＧ２１:幼仓鼠肾细胞(babyhamsterkidney) CPE:细胞病变(cytopathiceffect) Ct:循环阈值(cyclethreshold) DEPC:焦碳酸乙二酯(diethylpyrocarbonate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymeＧlinkedimmunosorbentassay) FITC:异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate) HmluＧ１:仓鼠肺细胞(hamsterlungcell) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) PBST:含吐温Ｇ２０的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsalinewithtweenＧ２０) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RTＧPCR:反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionＧpolymerasechainreaction) SPF:无特定病原体(specificpathogenfree) TCID５０:半数组织感染量(mediantissuecultureinfectivedose) TMB:３,３′,５,５′Ｇ四甲基联苯胺(３,３′,５,５′Ｇtetramethylbenzidine) Vero:非洲绿猴肾细胞(verdarenocell) ５　生物安全措施 按照GB１９４８９的规定执行. ６　临床诊断 ６􀆰１　流行病学 １NY/T５４９—２０２５ ６􀆰１􀆰１　传染源:病牛、病羊及带毒动物是最主要的传染源.病毒主要存在于有病毒血症的血液中,偶尔也 可从胚胎组织中分离到. ６􀆰１􀆰２　传播途径:主要通过蚊子和库蠓等媒介昆虫传播,一般不通过直接接触传播,可垂直传播. ６􀆰１􀆰３　易感动物:牛、绵羊、山羊等家养反刍动物均易感,尤以牛发病常见,马、骆驼等也可感染本病. ６􀆰１􀆰４　流行特点:赤羽病一般呈零星散发,但当有良好的虫媒生活环境(充沛雨水、适宜温度)及虫媒从疫 区迁移至其他地区感染易感动物时,可能会导致该病大规模暴发. ６􀆰２　临床症状 ６􀆰２􀆰１　成年活畜:成年牛、绵羊和山羊一般无症状或出现轻微临床症状,但怀孕母畜感染后流产率和后代 先天性畸形率增加,可见死胎、早产胎和木乃伊胎等. ６􀆰２􀆰２　新生幼畜:主要症状为先天性畸形.可见关节弯曲、积水性无脑、共济失调、肌肉发育不良等.畸 形的发生率取决于母畜感染时的妊娠阶段和品种. ６􀆰３　病理变化 神经和肌肉病变,如非化脓性脑脊髓炎、局部脑