2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 中 7 种 大 环 内 酯 类 药 物 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 7 4 9 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s e v e n m a c r o l i d e s i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７４９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院. 本文件主要起草人:龚兰、魏瑞成、王冉、栾枫婷、陈明、邵雪梅、刘传辉、朱磊、唐敏敏、张莉莉、段玲、 袁驴军. ⅠNY/T４７４９—２０２５ 饲料中７种大环内酯类药物的测定 液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中７种大环内酯类药物的液相色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中螺旋霉素 (以螺旋霉素Ⅰ计)、阿奇霉素、替米考星、红霉素(以红霉素A计)、泰乐菌素(以泰乐菌素A计)、克拉霉素 和罗红霉素等７种大环内酯类药物的测定. 本文件的检出限为０􀆰０２mg/kg,定量限为０􀆰０５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的待测物用氨化乙腈提取,经固相萃取柱净化,用液相色谱串联质谱仪测定,基质匹配标准溶 液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２规定的一级不. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　乙腈:色谱纯. ５􀆰４　甲酸:色谱纯. ５􀆰５　１０％甲醇溶液:取１００mL甲醇,加水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰６　１％氨化乙腈溶液:取１０mL氨水,加乙腈稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰７　氢氧化钠溶液(５􀆰０mol/L):称取１００g氢氧化钠,溶解于５００mL水中,混匀. ５􀆰８　磷酸盐缓冲溶液(０􀆰１mol/L,pH＝９􀆰０±０􀆰４):准确称取６􀆰８０g磷酸二氢钾,溶于水中,加水至约 ４８０mL,用５􀆰０mol/L氢氧化钠(５􀆰７)调节pH至９􀆰０±０􀆰４,用水定容至５００mL,混匀. ５􀆰９　５％氨化甲醇溶液:取５mL氨水,加甲醇稀释至１００mL,混匀. ５􀆰１０　０􀆰１％甲酸水溶液:取１mL甲酸(５􀆰４),加水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１１　０􀆰１％甲酸乙腈溶液:取１mL甲酸(５􀆰４),加乙腈稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１２　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取螺旋霉素Ⅰ、阿奇霉素、替米考星、红霉素A、泰乐菌素A、克 拉霉素和罗红霉素标准品或对照品各１０mg(纯度等按附录A执行),精确至０􀆰０１mg,分别于１０mL容 量瓶中,用甲醇(５􀆰２)溶解,定容,混匀.于－１８℃以下保存,有效期３个月. ５􀆰１３　混合标准中间溶液(１μg/mL):准确移取各标准储备溶液(５􀆰１２)０􀆰１mL于１００mL容量瓶中,用 １NY/T４７４９—２０２５ １０％甲醇溶液(５􀆰５)稀释至刻度,混匀,备用.于２℃~８℃下保存,有效期１周. ５􀆰１４　混合标准系列工作溶液:准确移取适量体积的混合标准中间溶液(５􀆰１３),用１０％甲醇溶液(５􀆰５)稀 释配制成质量浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、２００ng/mL混合标准系 列工作溶液.临用现配. ５􀆰１５　固相萃取柱:氮乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯共聚物的混合型反相填料,２００mg/６mL. ５􀆰１６　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ６􀆰１　分析天平:精度０􀆰０１g和０􀆰０１mg. ６􀆰１　涡旋混合器. ６􀆰１　超声波清洗器. ６􀆰１　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰１　氮吹仪. ６􀆰１　固相萃取装置. ６􀆰１　酸度计:精度±０􀆰０１. ７　样品 按GB/T２０１９５的规定制备试样,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的试验筛,充分混 匀,装入密闭容器中,备用.选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于 方法定量限３０％的饲料样品,作为基质空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取２g(精确至０􀆰０１g)试样于５０mL离心管中,准确加入１０mL１％氨化乙腈溶 液(５􀆰６),涡旋混合１min,超声提取２０min,其间充分摇动２次,于８０００r/min离心５min,取上清液于另 一个５０mL离心管中;于残渣中加入１０mL１％氨化乙腈溶液(５􀆰６),重复提取一次,合并上清液,准确移 取１mL上清液,于４０℃下氮吹至近干,加入５mL磷酸盐缓冲溶液(５􀆰８)溶解残渣,涡旋混合１min, 备用. ８􀆰２　净化 依次用５mL甲醇(５􀆰２)、５mL水和５mL磷酸盐缓冲溶液(５􀆰８)活化固相萃取柱(５􀆰１５),将备用液 (８􀆰１)全部过柱,用５mL水淋洗,真空负压抽干,用６mL５％氨化甲醇溶液(５􀆰９)洗脱,收集洗脱液,真空 负压抽干后,洗脱液于４０℃下氮吹至近干,准确加入１mL１０％甲醇溶液(５􀆰５)溶解残渣,涡旋混匀,过微 孔滤膜(５􀆰１６),待测. ８􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液的制备 取基质空白样品,按８􀆰１和８􀆰２处理至“洗脱液于４０℃下氮吹至近干”,准确加入１mL混合标准系 列工作溶液(５􀆰１４)溶解残渣,涡旋混匀,过滤膜(５􀆰１６),配制成质量浓度为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、 ２０ng/mL、５０ng/mL和２００ng/mL的基质匹配混合标准系列溶液,待测. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm;或性能相当者; b)柱温:４０℃; ２NY/T４７４９—２０２５ c)流速:０􀆰３mL/min; d)进样量:２μL; e)流动相:A相为０􀆰１％甲酸水溶液(５􀆰１０),B相为０􀆰１％甲酸乙腈溶液(５􀆰１１),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间 minA相 ％B相 ％ ０􀆰００ ９０ １０ １􀆰００ ９０ １０ ２􀆰００ ８０ ２０ ５􀆰００ ５０ ５０ ６􀆰００ １０ ９０ ７􀆰００ １０ ９０ ７􀆰０１ ９０ １０ １２􀆰００ ９０ １０ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)喷雾电压:５􀆰５kV; d)雾化温度:５００℃; e)多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量参考值见表２. 表２　多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量参考值 被测物名称监测离子对 m/z去簇电压 V碰撞能量 eV 螺旋霉素Ⅰ８４３􀆰６/１７４􀆰２a１６０ ４３ ８４３􀆰６/５４０􀆰５ １６０ ４１ 阿奇霉素７４９􀆰５/５９１􀆰３a６０ ２８ ７４９􀆰５/１５８􀆰０ ６０ ３７ 替米考星８６９􀆰５/６９６􀆰３a３８ ５９ ８６９􀆰５/１７４􀆰３ ３８ ５８ 红霉素A７３４􀆰３/５７６􀆰３a７６ ２７ ７３４􀆰３/１５８􀆰２ ７６ ３６ 泰乐菌素A９１６􀆰５/１７４􀆰１a８７ ４９ ９１６􀆰５/７７２􀆰３ ８７ ４０ 克拉霉素７４８􀆰５/１５８􀆰０a５０ ３６ ７４８􀆰５/５９０􀆰４ ５０ ２７ 罗红霉素８３７􀆰４/１５８􀆰２a ７４ ４３ ８３７􀆰４/６７９􀆰４ ７４ ３０ 　　a　为定量离子. ８􀆰４􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８􀆰２)上机测定.基质匹配标 准溶液的定量离子色谱图见附录B. ８􀆰４􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差应在±２􀆰５％之 内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹 配标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度,若偏差不超过表３规定的范围,则可判定为样品中存 在对应的待测物. ３NY/T４７４９—２０２５ 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ８􀆰４􀆰５　定量 以基质匹配