2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 中 大 观 霉 素 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 7 4 8 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f S p e c t i n o m y c i n i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 2 0 8 6 号 公 告 — 7 — 2 0 1 4NY/T４７４８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替农业部２０８６号公告—７—２０１４«饲料中大观霉素的测定»,与农业部２０８６号公告—７— ２０１４相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　适用范围中增加了混合型饲料添加剂(见第１章); b)更改了原理(见第４章,２０１４年版的第３章); c)删除了液相色谱法(见２０１４年版的第４章); d)更改了试剂或材料(见第５章,２０１４年版的５􀆰１); e)更改了提取和净化方法(见８􀆰１和８􀆰２,２０１４年版的５􀆰３); f)更改了色谱和质谱的参考条件(见８􀆰４,２０１４年版的５􀆰３􀆰３􀆰１); g)增加了单点校准计算公式(见第９章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:浙江大学、浙江万方生物科技有限公司 本文件主要起草人:王凤芹、汪以真、刘金松、程远之、路则庆、靳明亮、刘波静、冯杰、单体中、杜华华、 宗鑫、开丽霞、王新霞、杨彩梅. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１４年首次发布为农业部２０８６号公告—７—２０１４; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４７４８—２０２５ 饲料中大观霉素的测定液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中大观霉素的液相色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中大观霉素 的测定. 本文件检出限为１mg/kg,定量限为２mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中大观霉素用三氯乙酸溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液提取并络合金属离子,经混合型阳离子交 换固相萃取小柱净化,液相色谱串联质谱仪测定,基质添加标准曲线校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　甲酸:色谱纯. ５􀆰３　甲醇:色谱纯. ５􀆰４　乙腈:色谱纯. ５􀆰５　甲酸铵:色谱纯. ５􀆰６　２％三氯乙酸溶液:称取２０g三氯乙酸,加水溶解并稀释定容至１０００mL,混匀. ５􀆰７　５％乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧ２Na)溶液:称取５gEDTAＧ２Na,加水溶解并稀释定容至１００mL, 混匀. ５􀆰８　１０％氨水溶液:取１０mL氨水,加水稀释定容至１００mL,混匀. ５􀆰９　１０％氨化甲醇溶液:取１０mL氨水,加甲醇(５􀆰３)稀释定容至１００mL,混匀. ５􀆰１０　甲酸铵甲酸溶液:称取０􀆰６３g甲酸铵(５􀆰５),用１００mL水溶解,再加入４mL甲酸(５􀆰２),用水定 容至１０００mL,混匀. ５􀆰１１　甲酸铵甲酸乙腈溶液:称取０􀆰６３g甲酸铵(５􀆰５),用１００mL水溶解,再加入４mL甲酸(５􀆰２),用 乙腈(５􀆰４)定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１２　复溶液:甲酸铵甲酸溶液(５􀆰１０)和甲酸铵甲酸乙腈溶液(５􀆰１１)等体积混合. ５􀆰１３　标准储备溶液(１􀆰０mg/mL):称取１２􀆰１９mg(精确至０􀆰０１mg)盐酸大观霉素(CAS:２１７３６Ｇ８３Ｇ４,纯 度≥９８􀆰５％)于１０mL容量瓶中,加水溶解,定容.于２℃~８℃保存,有效期３个月. １NY/T４７４８—２０２５ ５􀆰１４　标准中间溶液(２００􀆰０mg/L):准确移取大观霉素标准储备溶液(５􀆰１３)２􀆰５mL于５０mL容量瓶中, 用复溶液(５􀆰１２)稀释并定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期１４d. ５􀆰１５　混合型阳离子交换固相萃取小柱:６０mg/３mL,或性能相当者. ５􀆰１６　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰００１g和０􀆰０１mg. ６􀆰３　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰４　超声波清洗仪. ６􀆰５　固相萃取装置. ６􀆰６　氮吹仪:控温精度±２℃. ６􀆰７　酸度计:精度±０􀆰０１. ７　样品 按照GBT２０１９５的规定制备试样,至少２００g,配合饲料、浓缩饲料和精料补充料粉碎使其全部过 ０􀆰４２５mm试验筛,充分混匀,添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂无需粉碎,混合均匀,装入密闭容器 中,备用.选取类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处,其仪器响应值小于方法定量限相应值３０％ 的饲料样品,作为空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取２􀆰５g(精确至０􀆰００１g)试样于５０mL塑料离心管中,准确加入２３mL三氯 乙酸溶液(５􀆰６)和２mLEDTAＧ２Na溶液(５􀆰７),超声提取２０min,其间振摇１次,于８０００r/min离心 ５min,转移上清液至另一５０mL塑料离心管中.重复提取１次并离心,合并上清液,混匀.准确移取 ３mL提取液(V１)至１０mL塑料离心管中,用氨水溶液(５􀆰８)调节pH至４􀆰７±０􀆰２后,于８０００r/min离 心５min,备用. ８􀆰２　净化 依次用３mL甲醇和３mL水活化固相萃取小柱(５􀆰１５),将样品备用液(８􀆰１)全部过柱,分别用３mL 水(５􀆰１)和３mL甲醇(５􀆰３)淋洗,抽干.用３mL氨化甲醇溶液(５􀆰９)洗脱,全部洗脱液于４０℃氮气吹干, 准确加入３mL(V２)复溶液(５􀆰１２),微孔滤膜(５􀆰１６)过滤,待测. ８􀆰３　基质添加标准系列溶液的制备 取适量的标准中间溶液(５􀆰１４),加入到空白试样中(７),充分混匀,按８􀆰１~８􀆰２步骤处理,使得到的基 质添加标准系列溶液中大观霉素浓度分别为０(g/mL、０􀆰１(g/mL、０􀆰２(g/mL、０􀆰５(g/mL、１􀆰０(g/mL、 ２􀆰０(g/mL、５􀆰０(g/mL、１０􀆰０(g/mL基质添加标准系列溶液.临用现配. ８􀆰４　仪器参考条件 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:亲水相互作用(HILIC)色谱柱,柱长５０mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm.或性能相当 者; b)流动相:A相为甲酸铵甲酸溶液(５􀆰１０),B相为甲酸铵甲酸乙腈溶液(５􀆰１１),梯度洗脱,梯度洗 脱程序见表１; c)流速:０􀆰５mL/min; ２NY/T４７４８—２０２５ d)柱温:３０℃; e)进样量:５μL. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A相,％ B相,％ ０􀆰０ ０ １００ １􀆰０ ０ １００ １􀆰５ ５０ ５０ ３􀆰０ ５０ ５０ ３􀆰１ ０ １００ ５􀆰０ ０ １００ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)毛细管电压:０􀆰５kV; d)脱溶剂气温度:５５０℃; e)脱溶剂气流速:１０００L/Hr; f)雾化气、干燥气为高纯氮气,碰撞气为高纯氩气; g)大观霉素的定性离子对、定量离子对和碰撞能量参考值见表２. 表２　大观霉素的定性离子对、定量离子对和碰撞能量参考值 化合物 母离子,m/z 子离子,m/z 锥孔电压,V 碰撞能量,eV 大观霉素 ３５１􀆰２３３３􀆰３a ２０７􀆰２３０３４ ２２ 　　a　为定量离子. ８􀆰５　测定 ８􀆰５􀆰１　基质添加标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质添加标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８􀆰２)上机测定.基质添加标 准溶液中大观霉素定量离子对色谱图见附录A. ８􀆰５􀆰２　定性 在相同试验条件下,试样溶液中大观霉素的保留时间应与基质添加标准系列溶液(浓度相当者)中大 观霉素的保留时间一致,其相对偏差在±２􀆰５％之内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中大观 霉素监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度,若偏 差不超过表３规定的范围,则可判定为样品中存在大观霉素. 表３　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度/(％) ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 允许的最大偏