2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 中 杆 菌 肽 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 7 4 6 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f b a c i t r a c i n i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７４６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:宁波市农产品质量检测中心、浙江正明检测有限公司. 本文件主要起草人:吴银良、徐峰、付岩、朱勇、孙梅梅、王克然、马艳、吴市学、史西志、王全胜. ⅠNY/T４７４６—２０２５ 饲料中杆菌肽的测定　液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中杆菌肽的液相色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中杆菌肽(以 杆菌肽A、杆菌肽B１、杆菌肽B２和杆菌肽B３之和计)的测定. 本文件杆菌肽A、杆菌肽B１、杆菌肽B２和杆菌肽B３的检出限为０􀆰０２mg/kg,定量限为０􀆰０５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件.不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的待测物用乙腈、甲醇和氨水混合溶液提取,经C１８固相萃取柱净化后,用液相色谱串联质谱 仪测定,基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　乙腈:色谱纯. ５􀆰３　甲醇:色谱纯. ５􀆰４　甲酸:色谱纯. ５􀆰５　氢氧化钠溶液(１mol/L):称取２０g氢氧化钠溶于４００mL水中,用水稀释至５００mL,混匀. ５􀆰６　乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧ２Na)溶液(１􀆰５mmol/L):称取０􀆰２５gEDTAＧ２Na溶于４５０mL水中,用 氢氧化钠溶液(５􀆰５)调pH至７􀆰０后,用水稀释至５００mL,混匀. ５􀆰７　氨水溶液:取１２mL氨水,用水稀释至１００mL,混匀. ５􀆰８　提取液:分别量取乙腈(５􀆰２)、甲醇(５􀆰３)和氨水溶液(５􀆰７)各１００mL,混匀. ５􀆰９　１５％乙腈溶液:移取１５mL乙腈(５􀆰２),用水稀释至１００mL,混匀. ５􀆰１０　０􀆰１％甲酸溶液:移取１mL甲酸(５􀆰４),用水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１１　２０％甲醇溶液:移取２００mL甲醇(５􀆰３),用水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１２　０􀆰１％甲酸甲醇溶液:移取１mL甲酸(５􀆰４),用甲醇稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰１３　标准储备溶液(２００μg/mL):称取适量杆菌肽A(CAS号:２２６０１Ｇ５９Ｇ８,纯度≥９０％)、杆菌肽B１ (CAS号:５７７６２Ｇ７９Ｇ５,纯度≥９０％)、杆菌肽B２(CAS号:５７７６２Ｇ７８Ｇ４,纯度≥９０％)和杆菌肽B３(CAS号: １４９１４６Ｇ３２Ｇ７,纯度≥９０％)标准品,精确至０􀆰０１mg,分别置于１０mL容量瓶中,用甲酸甲醇溶液(５􀆰１２)溶 解并定容.－１８℃以下保存,有效期６个月. １NY/T４７４６—２０２５ ５􀆰１４　混合标准储备溶液(５０μg/mL):准确移取标准储备溶液(５􀆰１３)各２mL,混匀.－１８℃以下保存, 有效期３个月. ５􀆰１５　混合标准中间溶液(１０μg/mL):准确移取２mL混合储备溶液(５􀆰１４)于１０mL容量瓶中,用甲酸 甲醇溶液(５􀆰１２)定容,混匀.－１８℃以下保存,有效期２个月. ５􀆰１６　混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液(５􀆰１５),用甲醇溶液(５􀆰１１)稀释配制成质量浓 度分别为０􀆰０１μg/mL、０􀆰０２μg/mL、０􀆰０５μg/mL、０􀆰１μg/mL、０􀆰５μg/mL和１μg/mL的混合标准系列 溶液,混匀.临用现配. ５􀆰１７　C１８固相萃取柱:５００mg/６mL,或相当者. ５􀆰１８　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源. ６􀆰２　离心机:转速不低于９５００r/min. ６􀆰３　分析天平:精度０􀆰０１mg和０􀆰０１g. ６􀆰４　振荡器:转速不低于３００r/min. ６􀆰５　涡旋混合器. ６􀆰６　固相萃取装置. ６􀆰７　氮吹仪. ６􀆰８　pH计:精度±０􀆰１. ７　样品 按GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的试验筛,充分混 匀,装入磨口瓶中,备用.选取类型相同,均匀一致、且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限 ３０％的饲料样品,作为空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０１g),置于５０mL离心管中,准确加入１０mL提取液 (５􀆰８),涡旋３０s后,振荡提取１５min,９５００r/min离心３min,移取上清液至另一离心管中.重复提取１ 次,合并上清液,准确移取５mL上清液,加入１０mLEDTAＧ２Na溶液(５􀆰６),混匀,备用. ８􀆰２　净化 依次用５mL甲醇(５􀆰３)、５mL水(５􀆰１)活化固相萃取小柱(５􀆰１７),取备用液(８􀆰１)过柱,用３mL乙腈 溶液(５􀆰９)淋洗,３mL甲醇(５􀆰３)洗脱,收集洗脱液于１０mL离心管中,４０℃氮气吹干,准确加入甲醇溶液 (５􀆰１１)１mL溶解残渣,涡旋３０s,微孔滤膜(５􀆰１８)过滤,待测. ８􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液的制备 称取相同质量的空白试样,按照８􀆰１和８􀆰２步骤操作至“４０℃氮吹至干”后,分别准确加入１mL混合 系列标准溶液(５􀆰１６)溶解残渣,混匀,微孔滤膜(５􀆰１８)过滤,配制成质量浓度分别为０􀆰０１μg/mL、０􀆰０２ μg/mL、０􀆰０５μg/mL、０􀆰１μg/mL、０􀆰５μg/mL和１μg/mL的基质匹配混合标准系列溶液. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm,或性能相当者; b)柱温:３５℃; ２NY/T４７４６—２０２５ c)进样量:１０μL; d)流速:０􀆰３mL/min; e)流动相:A相为甲酸溶液(５􀆰１０);B相为乙腈(５􀆰２),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间 minA相 ％B相 ％ ０ ８０ ２０ ０􀆰２ ８０ ２０ ６􀆰０ ７２ ２８ ６􀆰１ ２０ ８０ ７􀆰０ ２０ ８０ ７􀆰１ ８０ ２０ ９􀆰０ ８０ ２０ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)毛细管电压:３􀆰０kV; d)离子源温度:１５０℃; e)脱溶剂温度:６００℃; f)脱溶剂气:氮气１０００L/Hr. 待测物的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值见表２. 表２　待测物的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值 被测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV 杆菌肽A７１２􀆰０＞２２７􀆰０ ６０ ３５ ７１２􀆰０＞１９９􀆰１a ６０ ３５ 杆菌肽B１、B２和B３７０５􀆰０＞２２７􀆰０ ４０ ３５ ７０５􀆰０＞１９９􀆰３a ４０ ４５ 　　a　为定量离子对. ８􀆰４􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配混合标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８􀆰２)上机测定.基质匹 配混合标准溶液的定量离子色谱图见附录A. ８􀆰４􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配混合标准系列溶液(质量浓度相当)中待测物的保留时间一 致,其相对偏差在±２􀆰５％之内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子对的相对 离子丰度与质量浓度接近的基质匹配混合标准系列溶液中对应的定性离子对的相对离子丰度,若偏差不 超过表３规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ３NY/T４７４６—２０２５ ８􀆰４􀆰５　定量 以基质匹配混合标准溶液质量浓度为横坐标,定量离子对色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其相 关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液与基质匹配混合标准溶液中待测物的响应值均应在线性范围内,如超出 线性范围,应重新测定.单点校准定量时,试样溶