2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 中 吉 他 霉 素 的 测 定 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 7 4 5 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f k i t a s a m y c i n i n f e e d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７４５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:宁波市农产品质量检测中心、浙江正明检测有限公司. 本文件主要起草人:吴银良、徐峰、王全胜、付岩、朱勇、王克然、马艳、吴市学、史西志. ⅠNY/T４７４５—２０２５ 饲料中吉他霉素的测定 １　范围 本文件描述了饲料中吉他霉素的液相色谱串联质谱和高效液相色谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合性饲料添加剂中吉他霉素 (以吉他霉素A１、吉他霉素A４、吉他霉素A５和吉他霉素A１３之和计)的测定. 本文件方法的检出限和定量限按附录A的规定执行. ２　规范性引用文件 下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件.不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　液相色谱串联质谱法(仲裁法) ４􀆰１　原理 试样中的吉他霉素用乙腈提取,经增强型脂肪去除固相萃取柱净化后,用液相色谱串联质谱仪测定, 基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ４􀆰２􀆰１　水:符合GB/T６６８２规定的一级水. ４􀆰２􀆰２　乙腈:色谱纯. ４􀆰２􀆰３　甲醇:色谱纯. ４􀆰２􀆰４　甲酸铵:优级纯. ４􀆰２􀆰５　甲酸铵溶液(０􀆰０１mol/L):称取０􀆰６３g甲酸铵(４􀆰２􀆰４),加水溶解,定容至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰６　１０％甲醇溶液:取１００mL甲醇(４􀆰２􀆰３)与９００mL水混匀. ４􀆰２􀆰７　标准储备溶液(１mg/mL):分别称取吉他霉素A１、吉他霉素A４、吉他霉素A５和吉他霉素A１３标 准物质(纯度等按附录B的规定执行)各５mg(精确至０􀆰０１mg),分别置于１０mL容量瓶中,用乙腈 (４􀆰２􀆰２)溶解定容.－１８℃以下保存,吉他霉素A１３标准储备溶液有效期为３个月,吉他霉素A１、吉他霉 素A４和吉他霉素A５标准储备溶液有效期为６个月. ４􀆰２􀆰８　混合标准储备溶液(０􀆰１mg/mL):分别准确移取标准储备溶液(４􀆰２􀆰７)各１mL于１０mL容量瓶 中,用乙腈(４􀆰２􀆰２)稀释定容,混匀.－１８℃以下保存,有效期２个月. ４􀆰２􀆰９　混合标准中间溶液(１０μg/mL):准确移取１mL混合标准储备溶液(４􀆰２􀆰８)于１０mL容量瓶中, 用乙腈(４􀆰２􀆰２)稀释定容,混匀.－１８℃以下保存,有效期１个月. ４􀆰２􀆰１０　混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液(４􀆰２􀆰９),用甲醇(４􀆰２􀆰３)稀释配制成质量浓 度分别为０􀆰００５μg/mL、０􀆰０１μg/mL、０􀆰１μg/mL、０􀆰５μg/mL、１μg/mL和５μg/mL的混合标准系列溶 液,混匀.临用现配. ４􀆰２􀆰１１　增强型脂肪去除固相萃取柱:３００mg/３mL,或相当者. １NY/T４７４５—２０２５ ４􀆰２􀆰１２　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源. ４􀆰３􀆰２　离心机:转速不低于９５００r/min. ４􀆰３􀆰３　分析天平:精度０􀆰０１mg和０􀆰０１g. ４􀆰３􀆰４　振荡器:转速不低于３００r/min. ４􀆰３􀆰５　涡旋混合器. ４􀆰３􀆰６　固相萃取装置. ４􀆰４　样品 按GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的试验筛,充分混 匀,装入磨口瓶中,备用.选取类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限 ３０％的饲料样品,作为空白样品. ４􀆰５　试验步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 ４􀆰５􀆰１􀆰１　配合饲料、浓缩饲料和精料补充料 平行做２份试验.称取试样５g(精确至０􀆰０１g)于５０mL塑料离心管中,准确加入２０mL乙腈 (４􀆰２􀆰２),涡旋３０s,３００r/min振荡提取１５min,９５００r/min离心３min,上清液备用. ４􀆰５􀆰１􀆰２　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 平行做２份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０１g)于５０mL塑料离心管中,准确加入１０mL乙腈 (４􀆰２􀆰２),涡旋３０s,３００r/min振荡提取１５min,９５００r/min离心３min,上清液备用. ４􀆰５􀆰２　净化 准确移取２􀆰５mL备用液(４􀆰５􀆰１)过固相萃取柱(４􀆰２􀆰１１),用２mL甲醇(４􀆰２􀆰３)洗脱,收集洗脱液至 ５mL容量瓶中,用甲醇(４􀆰２􀆰３)定容,混匀;准确移取１mL此溶液于１０mL容量瓶中,用水稀释定容,混 匀,微孔滤膜(４􀆰２􀆰１２)过滤,待测. ４􀆰５􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液的制备 称取空白试样,按照４􀆰５􀆰１和４􀆰５􀆰２的操作制得空白基质试样溶液.分别准确移取５０μL混合系列 标准溶液(４􀆰２􀆰１０),用空白基质试样溶液定容至５mL,配制成质量浓度为０􀆰０５ng/mL、０􀆰１ng/mL、 １ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL和５０ng/mL的基质匹配混合标准系列溶液.现用现配. ４􀆰５􀆰４　测定 ４􀆰５􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm,或性能相当者; b)柱温:３５℃; c)进样量:１０μL; d)流速:０􀆰３mL/min; e)流动相:A相为甲酸铵溶液(４􀆰２􀆰５),B相为乙腈(４􀆰２􀆰２),液相色谱串联质谱法梯度洗脱程序见表１. 表１　液相色谱串联质谱法梯度洗脱程序 时间 minA相 ％B相 ％ ０􀆰０ ９０ １０ ４􀆰０ １０ ９０ ４􀆰５ １０ ９０ ４􀆰６ ９０ １０ ６􀆰０ ９０ １０ ２NY/T４７４５—２０２５ ４􀆰５􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)毛细管电压:３􀆰０kV; d)离子源温度:１５０℃; e)脱溶剂温度:６００℃; f)脱溶剂气:氮气１０００L/Hr. 待测物的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值见表２. 表２　待测物的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值 被测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV 吉他霉素A１７８６􀆰５＞１０９􀆰１ ２２ ３６ ７８６􀆰５＞１７４􀆰２a２２ ３０ 吉他霉素A４８１４􀆰５＞１０９􀆰１ ６６ ４２ ８１４􀆰５＞１７４􀆰２a６６ ３０ 吉他霉素A５７７２􀆰５＞１０９􀆰１ ８６ ３６ ７７２􀆰５＞１７４􀆰２a８６ ３０ 吉他霉素A１３８００􀆰５＞１０９􀆰１ １０ ４０ ８００􀆰５＞１７４􀆰２a１０ ３２ 　　a　定量离子对. ４􀆰５􀆰４􀆰３　基质匹配混合标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配混合标准系列溶液(４􀆰５􀆰３)和试样溶液(４􀆰５􀆰２)上机测定.标 准溶液的定量离子对色谱图见附录C中的C􀆰１. ４􀆰５􀆰４􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物(质量浓度相当)的保留时间一致,其 相对偏差在±２􀆰５％之内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子对的相对离子丰 度与质量浓度接近的基质匹配混合标准系列溶液中对应的定性离子对的相对离子丰度,若偏差不超过表 ３规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ４􀆰５􀆰４􀆰５　定量 以待测物基质匹配标准溶液质量浓度为横坐标,待测物定量离子对色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲 线,其相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性 范围内,如超出线性范围,应重新测定.单点校准定量时,试样溶液中待测物的质量浓度与基质匹配标准 溶液质量浓度相差不超过３０％. ４􀆰６　试验数据处理 试样中待测物的含量以质量分数wi表示,单位为毫克每千克(mg/kg).多点校准按公式(１)计算; 单点校准按公式(２)计算. wi＝ρ１×V×V２×V４ V１×V３×m×１０００(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ３NY/T４７４５—２０２５ ρi　———由基质匹配标准曲线查得的试样溶液中待测物质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); V———试样提取溶液体积的数