2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 犬 冷 冻 精 液 生 产 技 术 规 程 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 0 C C S B 4 7 4 4 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r c a n i n e f r o z e n s e m e n p r o d u c t i o n Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７４４—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由全国伴侣动物(宠物)标准化技术委员会(SAC/TC５４１)归口. 本文件起草单位:公安部南昌警犬基地、南昌理工学院医学院、农业农村部牛冷冻精液质量检验测试 中心(南京)、公安部昆明警犬基地、北京小动物诊疗行业协会. 本文件主要起草人:余盼、叶俊华、吴衍、熊前、李莲、李川武、王振云、王春亮、肖远鹏、李杰、项茹雪、 杨雪芹、潘芊芊. ⅠNY/T４７４４—２０２５ 犬冷冻精液生产技术规程 １　范围 本文件确立了犬冷冻精液生产的技术程序,规定了采精、精液品质检查、精液稀释、精液标识、精液冷 冻、精液储存和精液运输等技术环节的基本要求,描述了证实方法. 本文件适用于犬冷冻精液生产. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T５４５８　液氮生物容器 GB/T８１７０　数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T１４１７４　大口径液氮容器 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 采精　semencollection 徒手获取公犬精液的方法. ３􀆰２ 精子密度　spermconcentration 单位体积精液中的精子数. [来源:GB/T２５１７２—２０２０,３􀆰４] ３􀆰３ 精子活力　spermmotility 在３７℃下呈直线前进运动的精子占总精子数的百分率. [来源:GB/T２５１７２—２０２０,３􀆰３] ４　冷冻精液生产技术程序 冷冻精液生产技术程序包括采精、精液品质检查、精液稀释与标识、精液冷冻、冷冻精液储存和冷冻精 液运输等环节.犬冷冻精液生产技术流程见图１. ５　采精 ５􀆰１　公犬选择 公犬应具有种用价值、体质健康、无遗传疾病,不应有已发布的动物防疫法所明确的二类疫病中的任 何一种疾病. ５􀆰２　采精准备 ５􀆰２􀆰１　采精场所应保持安静,地面防滑,清洁卫生. ５􀆰２􀆰２　采精员应着洁净工作衣、帽和工作靴,戴一次性无毒手套. ５􀆰２􀆰３　玻璃器皿和采精器具清洁消毒应符合附录A的规定.集精管、集精杯、载玻片、盖玻片和精液处 １NY/T４７４４—２０２５ 图１　犬冷冻精液生产技术流程 理器皿应预热至３７℃,稀释液提前放置在３０℃~３５℃的水浴锅中预热. ５􀆰２􀆰４　显微镜载物台恒温板应预热至３７℃. ５􀆰２􀆰５　采精时,应清洁体表,擦干水渍.阴毛过长时应适度修剪.包皮确需冲洗的,冲洗干净,３０min后 方可采精. ５􀆰３　采精步骤 手握法采精时,应一只手戴无毒手套,按摩公犬包皮部.待阴茎开始勃起时,把包皮往上撸至露出阴 茎球,握住阴茎球后端,同时给阴茎适当的按压,当阴茎充分勃起后犬开始射精.舍弃最先射出的透明水 样液体;另一只手持集精杯或带漏斗的集精管置于阴茎下方,收集乳白色精液. ５􀆰４　清洁 采精结束后,应及时清洁场地. ５􀆰５　采精频率 根据公犬产精能力确定采精频率.成年公犬宜每周采精１次~２次. ６　精液品质检测 ６􀆰１　精液处理室准备 精液处理室应设精液检查、稀释和分装区,温度宜为２２℃~２５℃,不应太阳光直射. ６􀆰２　原精液质量 应符合表１的规定,其中任何一项不符合要求的则废弃. 表１　犬原精液质量 编号 项目 指标 证实方法 １ 外观 呈乳白色,均匀一致 目测 ２ 气味 略带腥味,无异味 鼻嗅 ３ 采精量 ≥１mL 见６􀆰３􀆰１ ４ 精子密度 ≥１×１０８个/mL 见６􀆰３􀆰２ ５ 精子活力 ≥６５％ 见６􀆰３􀆰３ ６􀆰３　证实方法 ６􀆰３􀆰１　采精量测定 读取集精管的刻度测定采精量,精度应不小于０􀆰１mL. ６􀆰３􀆰２　精子密度测定 ２NY/T４７４４—２０２５ 采用精子密度仪测定,应定期用血细胞计数板法校正. ６􀆰３􀆰３　精子活力 取５μL~１０μL中层精液,置于载玻片上,加盖玻片,在有３７℃恒温装置的相差显微镜下用２００倍~ ４００倍评定活力.每样片观察３个视野,计算平均值.使用自动分析仪器应按其检测方法操作.活力用 百分率表示. ７　精液稀释和标识 ７􀆰１　精液稀释 ７􀆰１􀆰１　稀释液总量计算 ７􀆰１􀆰１􀆰１　采精后应尽快稀释,放置时间不宜超过１５min.采用等温稀释.精液与稀释液温差不得超过 １℃,根据精液温度调节稀释液温度,不得反向操作. ７􀆰１􀆰１􀆰２　稀释液总量以体积V计,数值以毫升(mL)表示,按公式(１)计算. V＝v１×c s×v２－v１ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: v１———采精量的数值,单位为毫升(mL); c———精子密度的数值,单位为１０８个每毫升(１０８个/mL); s———每剂量中呈直线前向运动精子数,单位为１０８个; v２———剂量的数值,单位为毫升(mL). ７􀆰１􀆰１􀆰３　稀释液配方见附录B.采用一步法稀释时,稀释液总量为一步法稀释液的量.采用两步法稀释 时,稀释液的量为Ⅰ液和Ⅱ液之和,Ⅰ液和Ⅱ液比例可为１∶１. ７􀆰１􀆰２　精液稀释方法 ７􀆰１􀆰２􀆰１　一步法稀释 将水浴锅中的等温稀释液缓慢加入精液,摇匀.将稀释后的精液在２０℃~２５℃下分装、封口,将细 管放入３℃~５℃的低温柜中平衡１􀆰５h~４h. ７􀆰１􀆰２􀆰２　两步法稀释 使用两步法稀释时,可按下列方法操作: a)　将精液放入３２℃~３４℃的水浴锅中,将与精液等温的第Ⅰ液缓慢加入精液中,摇匀,并快速放 至３℃~５℃的低温柜中水浴降温,同时将第Ⅱ液放至３℃~５℃的低温柜中预冷; b)水浴降温下平衡１􀆰５h~２􀆰５h,加入等温的第Ⅱ液; c)完成稀释后可继续平衡４０min,并于低温柜中分装和封口. ７􀆰２　精液标识 储精细管标识应字迹清晰易认、信息齐全,标识内容应符合附录C的规定. ８　精液冷冻 ８􀆰１　上架 ８􀆰１􀆰１　封装后的细管精液上架码放时,将棉塞封口端靠近操作者,封装口端远离操作者.入冷冻仪时,亦 应如此放置. ８􀆰１􀆰２　不同犬的细管精液应分开码放并标记. ８􀆰２　冷冻 ８􀆰２􀆰１　程控冷冻法 采用程控冷冻法时,应在电脑中设置冷冻的最佳温度曲线,常见冷冻温度曲线见附录D.冷冻仪与低 温柜宜靠近,开启液氮罐阀门将冷冻仪降温至４℃,将已排满待冻细管的冷冻架迅速放入冷冻仪,盖严盖 ３NY/T４７４４—２０２５ 子,运行设定好的冷冻程序. ８􀆰２􀆰２　自制冷冻箱法 ８􀆰２􀆰２􀆰１　以液氮为冷源,用自制的冷冻箱冷冻细管时,冷冻箱的深度应在５０cm以上. ８􀆰２􀆰２􀆰２　在装有液氮的冷冻箱内放一个能漂浮在液氮上的冷冻架,调节冷冻架置物面与液氮面的距离, 一般为１cm~５cm,预冷５min~１０min. ８􀆰２􀆰２􀆰３　将细管精液上架码放,盖上盖子,熏蒸５min~１０min后投入液氮中. ９　冷冻精液质量检查 ９􀆰１　取样 每头公犬的冷冻精液样品应是同一批次的产品.同一头犬、相同生产工艺、同一天采精生产的冷冻精 液为一个批次.随机从液氮生物容器中抽取２支样品,样品离开液氮不应超过５s. ９􀆰２　检验类型 ９􀆰２􀆰１　常规检验 冷冻精液入库前检验. ９􀆰２􀆰２　型式检验 有下列情况之一时,应进行型式检验: a)　生产方抽样检验; b)　仲裁检验; c)质量监督抽样时选定项的检验. ９􀆰３　检验方法 ９􀆰３􀆰１　预先将水浴箱水温加热至３８℃~４０℃,取一支细管冷冻精液迅速浸泡入３８℃~４０℃水中并晃 动,待溶解后(约１min)立即取出,用吸水纸或纱布擦干水珠. ９􀆰３􀆰２　剪去封口端,将精液移入试管内,取解冻精液进行活力检查. ９􀆰３􀆰３　精子活力检测按照６􀆰３􀆰３的规定执行. ９􀆰４　判断规则 ９􀆰４􀆰１　样品精子活力不小于３０％,则判定该批次冷冻精液为合格. ９􀆰４􀆰２　样品精子活力小于３０％,应进行复检.复检后仍不符合规定的,判定该批次冷冻精液为不合格. ９􀆰４􀆰３　检测结果的极限数值判定按GB/T８１７０中修约值比较法执行. １０　冷冻精液储存 １０􀆰１　收集 收集的冷冻精液移入液氮罐保存时,应按犬只对冷冻精液储存位置做好标识,细管封口端宜在上、棉 塞封口端宜在下,迅速浸泡在液氮中. １０􀆰２　储存 １０􀆰２􀆰１　储存冻精的低温容器应符合GB/T５４５８和GB/T１４１７４的要求.冷冻精液应浸在液氮中,由专 人负责并及时观察补充液氮量. １０􀆰２􀆰２　发现液氮罐外壳结白霜,立即将精液转移入其他液氮罐内保存. １０􀆰２􀆰３　由一个液氮生物容器转移至另一个液氮生物容器时,间隔时间不得超过３s. １１　冷冻精液运输 １１