2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 牛 轮 状 病 毒 感 染 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 7 4 2 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r b o v i n e r o t a v i r u s i n f e c t i o n Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７４２—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 引言 Ⅲ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　临床诊断 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　样品的采集、处理、运输和保存 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　病毒分离与鉴定 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　间接免疫荧光染色 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　RTＧPCR方法 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　实时荧光RTＧPCR方法 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　病毒中和试验 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １２　间接ELISA抗体检测 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １３　综合判定 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　病毒分离鉴定及RTＧPCR方法溶液配制 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　细胞病变及荧光染色示意图 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　RTＧPCR方法引物序列及结果示意图 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　实时荧光RTＧPCR方法相关资料 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　中和抗体效价测定结果计算方法 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　牛轮状病毒VP６蛋白的表达与纯化 １６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录G(规范性)　酶联免疫吸附试验(ELISA)溶液配制 １７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４７４２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国兽医药品监察所、中国动物卫生与流行病学中心、金宇保灵生物药品有限公司. 本文件主要起草人:吴华伟、陈晓春、樊晓旭、刘丹、赵丽霞、苏佳、薛青红、孙翔翔、秦义娴、孔冬妮、 田莉莉、陈坚、高金源、孙淼、刘蒙达、邓永、黄小洁、陈延飞、张皓博、王嘉、薛麒、赵炜、杨青春、陈建、侯力丹、 焉鑫、李岭、王秉昆、高月异、翟天舒. ⅡNY/T４７４２—２０２５ 引　　言 轮状病毒(rotavirus,RV)是一种双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科,是重要的人畜共患病原之一,可 感染多种动物,常引起婴幼儿或幼龄动物的腹泻.牛轮状病毒(bovinerotavirus,BRV)于１９６８年被MeＧ bus等首次发现并命名为新生牛犊腹泻病毒(neonatalcalfdiarrheavirus,NCDV),我国于１９８０年在福建 首次发现.作为影响养牛业发展的最重要的腹泻类疾病之一,由BRV感染引起的犊牛腹泻已在全球养 牛国家和地区广泛流行,且被证实主要由A群RV引起,其临床发病常以精神沉郁、厌食、水样腹泻、脱水 和酸中毒为主要特征,并伴有细菌的继发感染,使临床症状进一步加重,病情恶化,死亡率显著上升,给养 牛业造成了严重的经济损失. 目前,我国尚无牛轮状病毒感染诊断技术的相关标准和规范.本文件参考了有关文献,并结合国内外 相关检测技术研究新成果,规定了间接免疫荧光染色、RTＧPCR、实时荧光RTＧPCR等病原学诊断方法及 病毒中和试验、间接ELISA抗体检测等血清学诊断方法,适用于我国A群牛轮状病毒感染诊断的需求. ⅢNY/T４７４２—２０２５ 　 　 　牛轮状病毒感染诊断技术 １　范围 本文件规定了牛轮状病毒感染的临床诊断、病原学诊断和血清学诊断方法的技术要求和操作规范. 本文件适用于牛轮状病毒感染的诊断、检测、监测以及流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款,其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BRI:牛轮状病毒感染(bovinerotavirusinfection) BRV:牛轮状病毒(bovinerotavirus) CPE:致细胞病变效应(cytopathiceffect) DMEM:达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco′smodifiedeaglemedium) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay) FBS:胎牛血清(fetalbovineserum) FITC:异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate) MA１０４:猴胚胎肾细胞(MA１０４cells) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline) PBST:吐温磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolutionwithtweenＧ２０) RTＧPCR:反转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction) TCID５０:半数组织感染量(mediantissuecultureinfectivedose) VNT:病毒中和试验(virusneutralizationtest) ５　临床诊断 ５􀆰１　流行病学 ５􀆰１􀆰１　传染源 病牛和隐性带毒牛是最主要的传染源.病毒污染的饲料、土壤、垫草和饮水也可引起传播. ５􀆰１􀆰２　传播途径 主要通过粪Ｇ口途径传播.患牛排出的粪便中含有大量病毒,进入环境中可通过消化道和呼吸道感染 健康牛群. ５􀆰１􀆰３　易感动物 所有品种、日龄和性别的牛均可感染,但多发生于１日龄~７日龄的犊牛,且感染后发病率较高,成年 １NY/T４７４２—２０２５ 牛多隐性耐过. ５􀆰１􀆰４　流行特点 一年四季均可发生,春季和秋季发病率更高,呈地方性流行. ５􀆰２　临床症状 潜伏期１８h~９６h.前期症状不明显,突然发病,精神沉郁,吃奶减少或废绝,体温正常或略偏高.典 型症状是严重腹泻,粪便呈黄褐色或乳白色,黏稠或呈水样,有时粪便附有肠黏膜及血液,含有未消化凝乳 块,肛门周围、后肢内侧及尾部常被粪便污染,排便次数不一,排便失禁,不断有稀粪从肛门流出.后期因 严重腹泻导致机体严重脱水,眼睛凹陷,重症时皮肤干燥,被毛粗乱,四肢无力,卧地不起,心力衰竭和代谢 性酸中毒而死亡. ５􀆰３　病理变化 主要局限于消化道,特别是小肠的空肠和回肠部,肠壁变薄,呈半透明状.肠内容物稀薄,呈黄褐色、 红色或灰褐色,一般无出血或充血,但有时小肠伴有广泛出血.小肠绒毛萎缩或脱落,肠系膜淋巴结显著 肿大,胆囊呈现肿大增生现象. ５􀆰４　结果判定 出现５􀆰２部分或全部临床症状,或出现５􀆰３剖检病理变化的发病牛,可判为BRI疑似病例.疑似病 例需进一步采样进行实验室诊断. ６　样品的采集、处理、运输和保存 ６􀆰１　仪器设备 ６􀆰１􀆰１　高速台式冷冻离心机. ６􀆰１􀆰２　涡旋混合振荡器. ６􀆰１􀆰３　研钵/组织匀浆器. ６􀆰１􀆰４　Ⅱ级生物安全柜. ６􀆰２　试剂材料 ６􀆰２􀆰１　PBS,按照附录A中A􀆰１的规定配制. ６􀆰２􀆰２　含１０００U/mL青霉素和链霉素的DMEM营养液.