2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 食 用 菌 中 硒 代 氨 基 酸 的 测 定 3 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 8 0 . 2 0 C C S B 4 7 2 3 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f S e l e n o - a m i n o A c i d s i n e d i b l e m u s h r o o m Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７２３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所、南昌市疾病预防控制中心、赣州 市综合检验检测院、江西省林业科学院、江西省农学会、江西省农业科学院农业应用微生物研究所、江西省 农业科学院农产品加工研究所、绿城农科检测技术有限公司、于都县农业农村局、宁都县农业农村局. 本文件主要起草人:胡丽芳、周瑶敏、徐俊、金永久、周龙华、高伟、廖且根、张标金、谢敏、聂根新、 邱素艳、李伟红、魏云辉、刘光宪、费丹、广业兰、沈思言、温志刚、王玫、章虎、张玉换、沈荣明、郭彩霞、 张贤源. ⅠNY/T４７２３—２０２５ 食用菌中硒代氨基酸的测定 １　范围 本文件描述了食用菌中硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的液相色谱串联质谱和液相 色谱电感耦合等离子体质谱测定方法. 本文件适用于食用菌中硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB２７６３　食品安全国家标准　食品中农药最大残留限量 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. 方法一　液相色谱串联质谱法 ４　原理 试样中硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸,用蛋白酶和崩溃酶水解提取,经超滤管离心 净化,液相色谱串联质谱仪测定,外标法定量. ５　试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯. ５􀆰１􀆰２　甲酸(HCOOH):色谱纯. ５􀆰１􀆰３　蛋白酶(CAS号:９０３６Ｇ０６Ｇ０):酶活力≥３􀆰５U/mg. ５􀆰１􀆰４　崩溃酶(CAS号:８５１８６Ｇ７１Ｇ６):BR,蛋白≥１０％(双缩脲法),纯度＞９８％. ５􀆰１􀆰５　抗坏血酸(C６H８O６,CAS号:５０Ｇ８１Ｇ７). ５􀆰１􀆰６　三羟甲基氨基甲烷(C４H１１NO３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１). ５􀆰１􀆰７　盐酸(HCl):１２mol/L. ５􀆰２　试剂配制 ５􀆰２􀆰１　２０􀆰０mg/mL蛋白酶溶液:称取蛋白酶(５􀆰１􀆰３)１􀆰００g,用水稀释定容至５０mL,摇匀,现用现配. ５􀆰２􀆰２　０􀆰２mol/L抗坏血酸溶液:称取抗坏血酸(５􀆰１􀆰５)３􀆰５２g,用水稀释定容至１００mL,摇匀,备用,现 用现配. ５􀆰２􀆰３　１０􀆰０mmol/LTrisＧHCl缓冲溶液:称取０􀆰６０６g三羟甲基氨基甲烷(５􀆰１􀆰６)溶于４５０mL水中,用 盐酸(５􀆰１􀆰７)调节pH至７􀆰５,加水稀释定容至５００mL,摇匀. ５􀆰２􀆰４　０􀆰１％甲酸溶液:量取甲酸(５􀆰１􀆰２)０􀆰１mL,加水定容至１００mL,摇匀. １NY/T４７２３—２０２５ ５􀆰３　标准品 ５􀆰３􀆰１　硒代半胱氨酸(C３H７NO２Se,CAS号:１０２３６Ｇ５８Ｇ５):纯度≥９５％,或经国家认证并授予标准物质证 书的标准物质或标准溶液. ５􀆰３􀆰２　甲基硒代半胱氨酸(C４H９NO２Se,CAS号:２６０４６Ｇ９０Ｇ２):纯度≥９８％,或经国家认证并授予标准物 质证书的标准物质或标准溶液. ５􀆰３􀆰３　硒代蛋氨酸(C５H１１NO２Se,CAS号:１４６４Ｇ４２Ｇ２):纯度≥９８％,或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质或标准溶液. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　硒代半胱氨酸标准储备液(１０００mg/L,按Se计):称取硒代半胱氨酸(５􀆰３􀆰１)２１􀆰２mg(精确至 ０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用０􀆰５mL甲酸(５􀆰１􀆰２)溶解后,用水稀释并定容至刻度.于０℃~４℃ 储存,有效期１个月. ５􀆰４􀆰２　甲基硒代半胱氨酸标准储备液(１０００mg/L,按Se计):称取甲基硒代半胱氨酸(５􀆰３􀆰２)２３􀆰１mg (精确至０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度.于０℃~４℃储存,有效期１个月. ５􀆰４􀆰３　硒代蛋氨酸标准储备液(１０００mg/L,按Se计):称取硒代蛋氨酸(５􀆰３􀆰３)２４􀆰８mg(精确至０􀆰０１mg),置 于１０mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度.于０℃~４℃储存,有效期１个月. ５􀆰４􀆰４　混合标准中间液(１􀆰０mg/L):分别准确量取０􀆰１０mL标准储备液(５􀆰４􀆰１、５􀆰４􀆰２、５􀆰４􀆰３)于 １００mL容量瓶中,用水稀释并定容至刻度,现用现配. ５􀆰４􀆰５　混合标准工作液(１００􀆰０ng/mL):准确量取１􀆰００mL混合标准中间液(５􀆰４􀆰４)于１０mL容量瓶 中,用水稀释并定容至刻度,现用现配. ５􀆰５　材料 ５􀆰５􀆰１　针式滤膜:水系,０􀆰２２μm. ５􀆰５􀆰２　超滤离心管:５mL/３kD,配１５mL外管,或性能相当者. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００００１g、０􀆰０００１g和０􀆰０１g. ６􀆰３　pH计:精确至０􀆰１. ６􀆰４　涡旋混合仪. ６􀆰５　恒温振荡器. ６􀆰６　高速匀浆机:转速不低于１５０００r/min. ６􀆰７　高速离心机:转速不低于１２０００r/min. ６􀆰８　网筛:孔径４２５μm. ６􀆰９　试样制备设备:匀浆机、高速粉碎机. ７　分析步骤 ７􀆰１　试样制备 ７􀆰１􀆰１　鲜样 食用菌样品取样部位按GB２７６３的规定执行,取不少于１０００g样品放置于匀浆机中匀浆均匀,于 －１８℃密封保存备用. ７􀆰１􀆰２　干样 取不少于２００g食用菌干样,放置于高速粉碎机中粉碎,过网筛(６􀆰８),制成待测样,于常温密封保存备用. ２NY/T４７２３—２０２５ ７􀆰２　试样提取与净化 称取试样(７􀆰１􀆰１)２g(精确至０􀆰０１g)或试样(７􀆰１􀆰２)０􀆰５g(精确至０􀆰０００１g)于５０mL离心管中,加 入０􀆰２mol/L抗坏血酸溶液(５􀆰２􀆰２)０􀆰５mL和１０􀆰０mmol/LTrisＧHCl缓冲溶液(５􀆰２􀆰３)８􀆰５mL, １５０００r/min高速匀浆１min,再加入２０􀆰０mg/mL蛋白酶溶液(５􀆰２􀆰１)１􀆰０mL、崩溃酶(５􀆰１􀆰４)２０mg,涡 旋混匀,于恒温振荡器上(３７±０􀆰５)℃振荡酶解１２h,１２０００r/min离心１０min,提取液经０􀆰２２μm针式, 滤膜(５􀆰５􀆰１)过滤转移至１５mL离心管中.取５􀆰０mL过滤液转移至超滤离心管中(５􀆰５􀆰２),５０００r/min 离心１０min,取超滤液０􀆰１mL加入０􀆰１％甲酸溶液(５􀆰２􀆰４)０􀆰９mL,混匀待测. ７􀆰３　标准曲线绘制 取空白试样,按７􀆰２处理得到空白超滤液,准确量取０􀆰１mL,分别准确量取适量混合标准工作液 (５􀆰４􀆰５),用０􀆰１％甲酸溶液(５􀆰２􀆰４)稀释定容至１􀆰０mL,配制成浓度分别为０􀆰２ng/mL、０􀆰５ng/mL、 １􀆰０ng/mL、５􀆰０ng/mL、１０􀆰０ng/mL和２０􀆰０ng/mL基质匹配标准系列溶液,液相色谱串联质谱仪测 定.以待测物特征离子质量色谱图峰面积为纵坐标、对应浓度为横坐标绘制标准曲线. ７􀆰４　测定 ７􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 a)　色谱柱:C１８柱(１００mm×３􀆰０mm,粒径１􀆰８μm),或性能相当者; b)　进样量:１０􀆰０μL; c)　流速:０􀆰２mL/min; d)　柱温:３５℃; e)　流动相:A为０􀆰１％甲酸溶液(５􀆰２􀆰４);B为甲醇(５􀆰１􀆰１),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A,％ B,％ ０􀆰０ ９８ ２ ３􀆰５ ８０ ２０ ４􀆰５ ０ １００ ５􀆰０ ０ １００ ５􀆰１ ９８ ２ ６􀆰０ ９８ ２ ７􀆰４􀆰２　质谱参考条件 a)　电离方式:电喷雾正离子模式; b)　扫描模式:多反应监测(MRM)模式; c)　干燥气温度:３００℃; d)　干燥气流速:１５L/min; e)　鞘气温度:３００℃; f)　鞘气流速:１２L/min; g)　定性定量离子和碰撞能量见表２. 表２　质谱分析参数 化合物 母离子,m/z 子离子,m/z 碰撞能量,eV 硒代半胱氨酸 １６８７４􀆰１∗１５ １３９􀆰９ ８ 甲基硒代半胱氨酸 １６７９５∗２５ ５５􀆰２ １８ 硒代蛋氨酸 １９８５６􀆰２∗２０ １８０􀆰８ ８ 　　∗　为定量离子. ３NY/T４７２３—２０２５ ７􀆰４􀆰３　定性测定 在同样测试条件下,试样溶