2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 莲 藕 腐 败 病 抗 性 鉴 定 技 术 规 程 1 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 2 0 C C S B 4 7 2 0 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r e v a l u a t i o n o f l o t u s r e s i s t a n c e t o l o t u s r h i z o m e r o t d i s e a s e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７２０—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院、全国农业技术推广服务中心、南京市浦口区现代农业发展服务 中心、南京市高淳区植保植检站、武汉市农业科学院、广昌县白莲产业发展中心、广西壮族自治区农业科学 院、金华市农业科学研究院. 本文件主要起草人:魏利辉、夏华兴、吴承东、周阳、邓晟、朱红莲、逯佳琪、杨良波、江文、张尚法、檀时 山、周冬梅、王楠、王晓宇、赵敏、张金凤、王凌云、宋瑞琪、滕辉、王贝、刘书勤. ⅠNY/T４７２０—２０２５ 莲藕腐败病抗性鉴定技术规程 １　范围 本文件确立了莲藕腐败病抗性鉴定程序,规定了接种方法和抗性鉴定的步骤与基本要求,描述了对应 的证实方法. 本文件适用于莲藕(NelumbonuciferaGaertn)品种及种质资源对腐败病的抗性鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. NY/T８３７　莲藕栽培技术规程 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 莲藕腐败病　lotusrhizomerotdisease 由尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl􀆰f􀆰sp􀆰nelumbicola)及其近缘种(F􀆰commune)侵染莲藕而 引起的一种土传、种传真菌病害.病原及发病症状见附录A. ３􀆰２ 接种体　inoculum 用于接种以引起病害发生的病原物或病原物的一部分. ３􀆰３ 莲子实生苗　seedlingsfromlotusseeds 成熟莲种子在适宜条件下发芽生长,形成具有独立根系、茎和叶的正常植株个体. ３􀆰４ 种藕营养体繁殖苗　seedlingsfromlotusrhizome 莲藕节上的芽在适宜条件下生长,形成具有独立根系、茎和叶的植株个体. ４　鉴定程序 莲藕腐败病抗性鉴定程序包括接种体的准备、病原菌接种和抗性鉴定三个阶段,流程如图１所示. ５　试剂与材料 除非另有说明,在本文件中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. 葡萄糖、马铃薯和琼脂,用于制备马铃薯葡萄糖(potatodextrosebroth,PDB)培养基和马铃薯葡萄糖 琼脂(potatodextroseagar,PDA)培养基. 蛭石和营养土用于植物材料的种植. ６　仪器及用具 高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、培养瓶、血球计数板和纱布等. １NY/T４７２０—２０２５ 图１　鉴定流程 ７　接种体的准备 接种的病原应选择当地致病性较强或致病频率较高的优势病原菌,其分离、鉴定和保存按照附录B. 保存的菌株首先转接至无菌的PDA培养基上活化,培养箱内２５℃生长７d;然后将适量活化的培养物转 接至装有无菌PDB培养基的培养瓶中,置于摇床内,在２５℃、１２０r/min~１８０r/min条件下振荡培养 ５d~７d. 培养结束后,用无菌纱布过滤PDB培养物以去除菌丝,之后在显微镜下检查滤出液,并用血球计数板 对滤出液中的分生孢子进行浓度计数,最后用无菌蒸馏水调整分生孢子浓度至１×１０６个分生孢子/mL, 备用. ８　病原菌接种 ８􀆰１　莲子实生苗接种 ８􀆰１􀆰１　实生苗准备 在成熟种子的胚芽侧(较圆滑的一侧),将种皮剪开直径５mm~７mm的圆形口,在加热至６０℃的蒸 馏水中浸种１５min,其间不定期搅拌,以清除种子表皮潜在病原物,同时促进后期种皮开裂和芽的萌发. 浸种后,将种子在无菌蒸馏水中浸泡４d~５d,直到大多数种子幼芽长度达到０􀆰５cm~１􀆰０cm,其间需更 换无菌蒸馏水,使水质始终保持清澈干净. ８􀆰１􀆰２　实生苗的接种方法 将发芽的莲子实生苗在上述病原菌的孢子悬浮液(１×１０６个孢子/mL)中浸泡６０min,每个品种或资 源至少接种３０粒发芽的种子,每１０粒种子作为一个重复. ８􀆰１􀆰３　实生苗的接种后管理 将处理的发芽莲子种植于湿润的灭菌混合基质中(营养土与蛭石体积比为１∶５),用少量蛭石覆盖 后,加入无菌蒸馏水,水层刚刚覆盖基质表面即可.种植环境需满足日平均环境温度大于等于２０℃,具备 自然光照,或光照１６h、黑暗８h的人工补光条件.此外,需要定期补充水分,同时做好虫害的防控. ２NY/T４７２０—２０２５ ８􀆰２　种藕营养体繁殖苗接种 ８􀆰２􀆰１　营养体繁殖苗准备 种藕质量应符合NY/T８３７的要求,其顶芽完整,且两侧至少具有２个完整节间,栽种于灭菌的混合 基质中(营养土与蛭石体积比为１∶２).其间正常水肥管理,同时做好虫害的防控. ８􀆰２􀆰２　营养体繁殖苗的接种方法 种植３０d~４５d后,待４片~５片叶长出,每节不定根８根~１０根时即可接种.将生长的藕苗连根小 心挖出,将根系浸泡于含有上述病原分生孢子的悬浮液(１×１０６个孢子/mL)中３０min.每个品种或资源 至少接种１５株苗,每５株为一个重复. ８􀆰２􀆰３　营养体繁殖苗的接种后管理 将接种后的植株移栽至湿润的灭菌混合基质中(营养土与蛭石体积比为１∶５),缓慢加水,待水层没 过栽培基质１cm~１􀆰５cm后即可.种植环境需满足日平均环境温度大于等于２０℃,具备自然光照,或光 照１６h、黑暗８h的人工补光条件.其间正常水肥管理,同时做好虫害的防控. ９　抗性鉴定 ９􀆰１　病情调查 根据当地环境温度、光照等条件,不定期观察全体植株的发病情况,当感病对照材料病情指数大于６０ 即可开展调查. 统计各处理中每株苗枯死叶片数占其所有可统计叶片数的比例,并按表１划分等级,然后将对应病情 级别的植株数量填入附录C中. 表１　病情级别的划分 病情级别 症状描述 ０ 无枯死叶片 １ 枯死叶片占可统计叶片数量的比例小于等于２５％ ２ 枯死叶片占可统计叶片数量的比例大于２５％,小于等于５０％ ３ 枯死叶片占可统计叶片数量的比例大于５０％,小于等于７５％ ４ 枯死叶片占可统计叶片数量的比例大于７５％ ９􀆰２　病情指数计算 病情指数(DI)按公式(１)计算. DI＝∑(s×n) N×S×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: s———各病情级别数值; n———各病情级别植株数; N———调查总株数; S———最高病情级别数值. ９􀆰３　抗性评价 抗性水平划分为５个级别,见表２. 表２　莲藕对腐败病抗性水平的分级 病情指数(DI) 抗性水平 DI＝０ 免疫(IM) ０＜DI≤３０ 抗病(R) ３０＜DI≤６０ 中抗(MR) ６０＜DI≤８５ 感病(S) DI＞８５ 高感(HS) ３NY/T４７２０—２０２５ ９􀆰４　有效性判别 感病对照材料病情指数大于６０即认为该批次抗性鉴定判定为有效.对于同一个鉴定材料,如果３次 重复抗性评价级别出现差异,且相差２级以上(含２个级别),则应对该材料做重复抗性鉴定. ９􀆰５　鉴定报告 依据实生苗或种藕营养体繁殖苗３次重复鉴定的病情指数(DI)的平均值,确定抗性水平,按照附录 C填写鉴定表格,撰写正式鉴定报告. ９􀆰６　鉴定材料后处理 鉴定完毕后将莲藕植株、残体及相关培养基质集中进行无害化处理. １０　证实方法 １０􀆰１　标记方法 在莲藕腐败病抗性鉴定材料准备阶段需要对所用的莲藕品种(资源)进行标记,标记的内容包括: a)　品种(资源)名称; b)　标记的编号; c)　做标记的试验人员姓名; d)　标记的时间; e)　其他. １０􀆰２　过程记录 在执行第６章和第７章所规定的各个阶段的程序指示过程中,记录并保留以下内容: a)　执行各个阶段程序指示的人员姓名; b)　时间; c)　地点; d)　具体操作内容; e)　操作的结果; f)　其他. ４NY/T４７２０—２０２５ 附　录　A (资料性) 莲藕腐败病病原及发病症状 A􀆰１　学名和形态描述 A􀆰１􀆰１　学名 莲藕腐败病病原为尖孢镰刀菌[FusariumoxysporumSchl􀆰f􀆰sp􀆰nelumbicola(Nis􀆰&Wat􀆰)Booth] 及其近缘种Fusariumcommune,属真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、丛赤壳科(Nectriaceae)、镰 刀菌属(Fusarium). A􀆰１􀆰２　形态描述 尖孢镰刀菌在PDA培养基上生长良好.初期菌落为白色,４d~５d后菌落中心可见紫红色,随着菌 落生长,紧贴培养基的菌丝颜色逐渐加深至紫色,菌落气生菌丝白色,绒状,致密(见