SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2979—2011 兔魏氏梭菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for rabbit clostridial disease 行业标准信息服务平台 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2979—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈兵、阮周曦、杨俊兴、秦智锋、陶虹、曹琛福、卢体康、花群义、张彩虹、陈书琨、 吕建强、林庆燕、孙洁、刘建利、廖立珊、宗卉。 行业标准信息服务平台 SN/T 2979—2011 兔魏氏梭菌病检疫技术规范 1范围 本标准规定了免魏氏梭菌病的临床诊断、病原分离鉴定、PCR检测方法技术要求。 本标准适用于对进出境兔魏氏梭菌病检疫和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3 生物安全措施 为保护实验室工作人员或检测人员的安全，所有培养物和废弃物应严格按照GB19489进行处理。 4兔魏氏梭菌病临床诊断 4.1临床症状 各种年龄和品种的兔均可感染发病，以1月龄～3月龄的幼免较多发生，发病不分季节。急性病例 突然发作，急剧腹泻，很快死亡。病兔精神沉郁，食欲减退或废绝，起初粪便不成形，很快变成带血色、胶 冻样、黑色或褐色稀便，且伴有特殊腥臭味，肛门周围后肢、尾部被毛被粪便污染。患兔严重脱水，四肢 无力，呈现昏迷状态，逐渐死亡。有的病兔死前出现抽搐，个别突然兴奋，尖叫一声，倒地而死。多数病 例从出现变形粪便到死亡约10h。少数病例病程约1星期或更长，最终死亡。 4.2病理变化 免魏氏梭菌病的剖检病变为户体脱水、消瘦，剖开腹腔有特殊的腥臭味，多数病例胃内充满饲料，胃 黏膜尤其胃底部黏膜严重脱落，胃壁有大小不等的出血斑和黑色溃疡；小肠充满气体，肠壁薄而透明；盲 肠、结肠内充满有腐败气味的黑绿色稀薄粪便；肠黏膜呈弥漫性充血、出血；肝脏质地变脆；脾脏萎缩呈 深褐色；心脏表面血管努张呈树枝状；数病例膀胱内积有茶色尿液 5病原分离与鉴定 5.1主要仪器与器材 5.1.1恒温培养箱。 5.1.2厌氧恒温培养箱。 5.1.3光学显微镜 SN/T 2979—2011 5.1.4PCR扩增仪。 5.1.5电泳仪。 5.1.6凝胶图像分析仪。 5. 1.7 普通冰箱和低温冰箱。 5. 1. 8 电动匀浆器或组织研磨器。 5. 1. 9 离心机和离心管。 5.1.10 微量移液器及吸头。 5.1.11 剪刀、镊子。 5. 1. 12 2平皿。 5.2试剂 5.2.1革兰氏染色液、0.05mol/LpH7.2PBS、厌氧肉肝汤、葡萄糖鲜血琼脂平板、各类生化检测试剂 等参见附录A。 5.2.2DEPC处理水、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇等。 5.3采样 按照GB/T18088的要求进行。无菌采取病死兔空肠、回肠、盲肠内容物、脏器和心血，采集后立即 冷藏送检或置缓冲甘油（用0.05mol/LpH7.2的PBS配制的50%的甘油溶液）中低温保藏。 5.4染色镜检 5.4.1涂片 取兔空肠内容物、肝、脾或细菌培养液、单个菌落制作涂片，以涂片背面在火焰上钟摆方式通过三次 进行固定。 5.4.2初染 在已固定的涂片上，滴加结晶紫染液，染色1min，水洗 5.4.3媒染 滴加革兰氏碘液，作用1min~3min，水洗。 5.4.4脱色 滴加95%酒精，并频频摇动玻片，至无紫色脱出为止（约20s），水 5.4.5复染 滴加复红染液复染1min～2min，水洗。用吸水纸印干后，油镜检查。 5.5分离培养 5.5.1样品处理 心血不需要处理，可直接用于细菌分离。 5.5.2细菌分离 取离心上清液或无菌采集的脏器及心血，接种于厌氧肉肝汤中，37℃于厌氧恒温培养箱培养20h～24h。 2