ICS65.020.01 CCSB10 JAASS 江苏省农学会团体标准 T/JAASS169—2025 蔬菜产地土壤和产品中耐药基因 风险评价技术规范 Technicalspecificationsforriskassessmentofantibioticresistancegenesin vegetable-producingsoilsandproducts 2025-06-26发布 2025-07-26实施 江苏省农学会  发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/JAASS169—2025 I目次 前言..................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4设备和工具、材料....................................................................1 5检验流程............................................................................2 6样品采集、运输、处理和保存..........................................................2 7样品总DNA提取及测序................................................................3 8宏基因组数据拼接、注释和分析........................................................3 9风险等级判定规则....................................................................4 10结果报告...........................................................................5 附录A（资料性）蔬菜中ESKAPE病原菌的分离鉴定方法.....................................6 全国团体标准信息平台 T/JAASS169—2025 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏省农学会提出并归口。 本文件起草单位：江苏省农业科学院、生态环境部南京环境科学研究所。 本文件主要起草人：何涛、魏瑞成、吉星、李俊、张莉莉、王冉、靳红梅、王娜。 全国团体标准信息平台 T/JAASS169—2025 1蔬菜产地土壤和产品中耐药基因 风险评价技术规范 1范围 本文件规定了蔬菜产地土壤和蔬菜产品中耐药基因风险评价的术语和定义、设备和材料、检验流程 和方法以及风险等级判定规则。 本文件适用于蔬菜产地土壤和蔬菜产品中耐药基因对人类健康风险的定性分级评价。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB4789.1食品卫生微生物学检验总则 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耐药基因antimicrobialresistancegenes 指微生物编码的可以对抗菌药物产生耐药性或敏感性下降的基因。 3.2 健康风险healthrisk 耐药基因通过土壤介质传递给蔬菜产品，人类假如食用了被耐药病原菌或耐药基因污染的蔬菜，可 能造成人类直接感染致病风险或引起人类肠道菌的耐药性。 3.3 可移动元件mobilegeneticelement 携带耐药基因的可移动基因序列，包括整合子、转座子、质粒、基因岛等。 3.4 ESKAPE病原菌ESKAPEpathogens ESKAPE代表了一组对多种抗生素具有高度耐药性的人类病原菌,包括：屎肠球菌（Enterococcus faecium，缩写E）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，缩写S）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,缩写K）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,缩写A）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,缩写P）和肠杆菌属细菌（Enterobacterspp.,缩写E）。 4设备和工具、材料 4.1设备 包括以下设备： ——冷藏运输箱：-20 ℃； ——均质仪； ——核酸浓度测定仪； ——微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL； ——电子天平:0.01 g； 全国团体标准信息平台 T/JAASS169—2025 2——水浴锅； ——纯水仪； ——生物安全柜； ——超低温冰箱：-80 ℃； ——生物信息分析服务器。 4.2工具和材料 包括以下物品： ——铁铲； ——圆形取土钻； ——无菌采集袋； ——剪刀； ——土壤DNA提取试剂盒； ——细菌基因组DNA提取试剂盒。 5检验流程 土壤和蔬菜产品中耐药基因的健康风险评价流程应按照图1进行。 图1土壤和蔬菜中耐药基因的健康风险评价流程 6样品采集、运输、处理和保存 6.1样品采集 6.1.1土壤 单个采样区是自然分割的一个田块，可采用对角线法、梅花点法、棋盘式法、蛇形法设计样品点， 采集土壤的深度为10 cm左右，每个点采集土壤不少于100 g,混合均匀后作为1个样本，放入无菌采样袋 中，标记信息，密封后-20 ℃冷藏运输。 6.1.2蔬菜 采集土壤采样区上对应的蔬菜样品，不同类型蔬菜应采集对应食用部分（果实或根、茎、叶等）， 每种类型的蔬菜采集不少于500 g，将其放入无菌袋中，标记信息，密封后-20 ℃冷藏运输。 6.2样品运输 全国团体标准信息平台 T/JAASS169—2025 3采集的样品按GB4789.1要求运达检验单位，运输时间应不超过24 h，运输工具应保持清洁，运输 过程中应防止包装破损导致样品渗漏。 6.3样品处理和保存 6.3.1样品运回实验室时，应确认样品完好情况。 6.3.2对于土壤样品，不用进行预处理可直接置于-80 ℃以备总DNA的提取。 6.3.3对于蔬菜样品，需要进行样本预处理，每种类型蔬菜分别进行处理。处理过程如下：用已灭菌 的超纯水清洗蔬菜3次～5次后，加入不少于1 L的0.85%无菌生理盐水，置于摇床震荡30min以上， 震荡产生的洗液过0.45μm滤膜收集菌体,将菌体用真空泵抽干后置于-80℃以备总DNA的提取。 7样品总DNA提取及测序 使用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤的总DNA，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取蔬菜样品处理后 的菌体DNA，使用核酸浓度测定仪测定所提取总DNA的浓度和纯度，经测定需要满足总DNA含量>2μg，同 时OD260/OD280介于1.6～2.0之间。将检测合格的DNA样本送至测序公司进行宏基因组二代测序，每个样 品测序的数据量为10 G。 8宏基因组数据拼接、注释和分析 8.1总则 获得宏基因组二代测序的原始数据后，使用本地生物信息分析服务器或委托生物技术公司开展宏基 因组原始测序数据的质控、序列拼接与基因预测、物种分类学注释、耐药基因注释、可移动元件注释、 耐药基因、可移动元件和宿主的共存情况分析。 8.2原始数据质控 根据Index序列区分各个样品的数据，提取出的数据以fastq格式保存，经过FastQC原始数据质量评 估后，使用Trimmomatic去除低质量碱基、接头序列等，获得高质量的cleanreads。 8.3序列拼接与基因预测 8.3.1序列拼接组装：基于De-Brujingraph原理，使用MEGAHIT，在默认参数下对质控后的cleanreads 进行拼接组装，通过多轮k-mer优化策略重叠构建contigs。 8.3.2基因预测：选择核酸长度≥1000 bp的contigs，使用Prodigal对contig进行ORF预测，使用 Bowtie2统计不同基因在对应样品中的相对丰度信息，相对丰度使用“TranscriptsPerMillion（TPM）” 表示，其定义为：每百万reads中对应某耐药基因的reads数。 8.4物种分类学注释 使用Kraken2将不同样本的宏基因组测序数据集中的每个样本的cleanreads进行k-mer切割，然后 将这些k-mer序列与物种参考数据库进行精确匹配，确定宏基因组数据中微生物物种分类及相对丰度。 8.5耐药基因注释 基于CARD与ResFinder数据库组建本地耐药基因数据库。使用DIAMOND进行蛋白/DNA的快速