ICS 65. 120 B 40 团 体 标 准 T/HXCY129-2025 杂交苜蓿种子真实性鉴定 SSR分子标记法 Authenticity identification of alfalfa hybrid seeds by SSR markers 2025-7-23发布 2025-7-24实施 北京华夏草业产业技术创新战略联盟 发布 全国团体标准信息平台 T/HXCY 129—2025 I 目 次 前 言 ................................ ................................ ................................ ................................ ....... II 1范围 ................................ ................................ ................................ ................................ ........ 1 2规范性引用文件 ................................ ................................ ................................ .................... 1 3术语和定义 ................................ ................................ ................................ ............................ 1 4缩略词 ................................ ................................ ................................ ................................ .... 2 5 原理 ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 2 6仪器设备 ................................ ................................ ................................ ................................ 3 7所需试剂 ................................ ................................ ................................ ................................ 3 8 引物 ................................ ................................ ................................ ................................ ....... 3 9 试验步骤 ................................ ................................ ................................ ............................... 4 10数据统计记录 ................................ ................................ ................................ ...................... 7 11结果判定 ................................ ................................ ................................ .............................. 7 全国团体标准信息平台 T/HXCY 129—2025 II 前 言 本文件按 照GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的结构和起草规 则》的规定起草 。 本文件由北京华夏草业产业技术创新战略联盟提出并归口。 本文件起草单位：内蒙古大 学、中国农业科学院草原研究所 、内蒙古农业大学 。 本文件主要起草人：崔乐乐、于林清、王照兰、 李俊、闫春霞、徐春波、 王运涛。 本文件为首次发布。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 全国团体标准信息平台 T/HXCY 129—2025 1 杂交苜蓿种子真实性鉴定 SSR分子标记法 1 范围 本文件规定了 SSR分子标记法鉴定 杂交苜蓿种子真实 性的术语和定义、 缩略词、原 理、仪器设备 、所需试剂、引物、 实验步骤、 数据统计分析及 结果分析 等内容。 本文件适用于杂交苜蓿种子真实性鉴定 、品种的审定、新品种知识产权保护及种子市 场监管。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 ，注日 期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 2930.4 草种子检验规程 发芽试验 GB/T 39917 主要农作物品种真实性和纯度 SSR分子标记检测 稻 DB 62/T 4094 草品种真实性检验规程 SSR标记法 DB 6521 /T 074 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单重复序列 simple sequence repeat (SSR) 是由1个～6个核苷酸为 基本单位，通过连续串联重复形成的 DNA片段，通常在 几十 个至几百个 bp之间，又称微卫星序列或短串联重复序列， 重复单元的数量在不同个体或物 种中高度可变，形成多态性标记，是遗传分析的重要工具。 3.2 琼脂糖凝胶电泳 agarose gel electrophoresis 是一种基于分子大小分 离DNA片段的常用分子生物学技术。琼脂糖凝胶电泳利用琼 脂糖凝胶作为介质，在电场作用下，使带负电的核酸分子（ DNA）从负极向正极迁移，通 过凝胶孔径的分子筛效应，实现不同大小核酸片段的分 离。分离后的核酸可通过染色进行 可视化分析 。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction (PCR) 全国团体标准信息平台 T/HXCY 129—2025 2 是一种在体外快速扩增特 定DNA片段的分子生物学技术，通过模拟 DNA天然复制过 程，实现目标序列的指数级扩增。 DNA双链变性：高温（约 95 ℃）使双链 DNA解链为 单链模板；引物退火：降温（通常是 55 ℃～65 ℃）使特异性引物与单链 DNA的互补区域 结合；链延伸： 在72 ℃左右下， DNA聚合酶以单链为模板，按照碱基互补配对原则， 以 5'→3'方向合成新链；重复循环上述步骤，实现 DNA指数增长。 3.4 引物 primer 是人工合成的 短核苷酸序列 （通常在 18 bp～30bp之间），能够通过碱基互补配对与模 板DNA特异性结合，引导 DNA聚合酶从 3'端开始合成新链 。 3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 是一种基于分子大小、电荷或构象分离 DNA的高分辨率电泳技术 。以聚丙烯酰胺凝 胶为介质，通过交联聚合反应，利用电场驱动带电分子迁移。 4 缩略词 下列缩略语适用于本文件 。 bp：base pair，碱基对 DNA：deoxyribonucleic acid ，脱氧核糖核苷酸 DNA marker ：用于比较 DNA片段大小的标准工具 TBE：电泳缓冲液 Taq酶： Taq-DNA polymerase ，耐热 DNA聚合酶 dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸 ddH 2O：双蒸水（超纯水） Loading Buffer ：上样缓冲液 5 原理 因基因组存在着能够世代遗传的简单重复序列，杂交种子具有双亲等位标记互补带 型。根据父母 本的特征 分子标记对应在杂交种中的 谱带，可判断该杂交种的真伪性。 SSR分子标记技术因其多态性 高、重复性好、操作简便等特点 ，是遗传分析的重要工 具。设计特异