ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 284—2025 牛流感病毒抗体血凝抑制试验检测方法 Hemagglutination inhibition test for detection of antibody against bovine influenza 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 284—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国动物疫病预防控制中心 提出。 本文件由 中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、广东省农业科学院农业生物基因研究中心、中国农 业科学院哈尔滨兽医研究所、北京中科基因技术股份有限公司。 本文件主要起草人： 刘颖昳、徐琦、李琦、王传彬、顾小雪、 毕一鸣、苗清新、余界石、邓国华、 原霖、司国辉、周智、倪建强、亢文华、刘玉良、孙雨、赵柏林、李晓霞、汪葆玥、王睿男、胡冬梅、 刘琳、王胜华、于宁卫、张媛、邢薿文、徐超。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 284—2025 1 牛流感病毒抗体血凝抑制试验检测方法 1 范围 本文件规定了牛流感病毒抗体血凝抑制试验的技术要求。 本文件适用于牛流感 病毒抗体的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血凝 Hemagglutination ，HA 流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白，具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性。 可通过观察红 细胞凝集现象，判定病毒效价。 3.2 血凝抑制 Hemagglutination inhibition ，HI 抗体特异性结合 HA分子的抗原位点，干扰流感病毒血凝素蛋白与红细胞受体之间的结合，抑制流 感病毒血凝素蛋白凝集红细胞的能力。 3.3 受体破坏酶 Receptor Damage Enzyme，RDE 别名神经氨酸苷酶 ，可破坏红细胞表面与病毒结合的受体，用于降低哺乳动物血清与红细胞表面受 体的非特异性结合 ，减少被检血清中包含的非特异性红 细胞凝集抑制物质的影响。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 HA：血凝（ Hemagglutination ） HAU：血凝单位（ Hemagglutination unit） HI：血凝抑制（ Hemagglutination Inhibition ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffer saline ） RDE（II）：II型受体破坏酶（ Receptor Damage Enzyme ） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 284—2025 2 5 设备和材料 5.1 可控温水浴锅（ 37 ℃、56 ℃）。 5.2 计时器。 5.3 微量移液器 （量程为 2 µL ~ 20 µ L、20 µ L ~ 200 µ L和200 µ L ~ 1000 µ L）。 5.4 1.5 mL 离心管。 5.5 96 孔血凝板（ V型， 90°，以下简称为血凝板） 。 6 试剂 6.1 阿氏液（ Alsever's Solution），按照附录 A中A.1配置。 6.2 压积鸡红细胞和 1 %（体积分数）鸡红细胞悬液，按照附录 A.2配置。 6.3 PBS（0.01 mol/L ，pH 7.2），按照附录 A.3配置。 6.4 受体破坏酶， RDE（II），购买商品化 试剂，按说明书使用。 6.5 分离培养所得的流感病毒血凝素分型标准抗原 ，或采用商品化试剂。 6.6 禽流感抗体阳性血清（ 禽流感抗体阳性的动物血清， 可为其他物种的血清，如鸡血清） 。 6.7 禽流感抗体阴性血清（ 禽流感抗体阴性的动物血清， 可为其他物种的血清，如鸡血清）。 7 血凝抑制试验 （HI） 7.1 样品前处理 7.1.1 鸡红细胞吸附去除特异性凝集素 使用 PBS将牛血清 稀释 5倍（体积分数）。将压积鸡红细胞按 1：10的比例（体积分数）加入稀释后 的牛血清。例如： 20 μ L待测牛血清在离心管中稀释至 100 μ L，加入 10 μ L压积红细胞。 轻轻颠倒混匀 ， 在4 °C下孵育 15 min进行吸附； 轻轻颠倒混匀 ，在 4 °C下再次孵育 15 min。以 2000 r /min转速在 4 °C下离 心5 min，使鸡红细胞 沉淀。小心吸取上层血清。 注：若样品无非特异性吸附，可不使用鸡红细胞预吸附去除非特异性凝集素。 非特异性 凝集检测的方法请参考附录 B。 7.1.2 RDE处理去除 非特异性病毒抑制 将RDE按说明书配制至工作浓度，在按 7.1.1处理后的牛血清中，加入 4倍体积的工作浓度的 RDE。 示例：在 7.1.1中，将 20 μL待测牛血清在离心管中稀释至 100 μL进行红细胞吸附，离心后得到吸附后的 血清中，含原始血清 20 μL，则应加入 80 μL RDE 。 在37 ° C下，将 RDE与牛血清的混合溶液孵育 18 h ~ 20 h。将血清样本在 56 ° C水浴中加热 30 min，使 RDE灭活。加入适量 PBS，使牛血清的最终稀释度达到 1：10。RDE处理后的血清可在 4 ° C下储存过夜， 如果需要更长时间的储存，需冷冻保存在 -20 ° C或更低的温度下。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 284—2025 3 7.2 HA试验操作步骤 7.2.1 使用微量移液器在 96孔血凝板 A行的第 1孔 ~ 第12孔加入 25 μL PBS ，并依次标记为 A1孔 ~ A12孔。 7.2.2 吸取流感病毒血凝素分型标准抗原溶液轻轻涡旋，混合均匀，向 A1孔中加入 25 μL待测病毒 抗原。 7.2.3 从A1孔中吸取 25 μL病毒液，从 A1孔连续转移至 A11孔，进行 2倍梯度稀释。从 A11孔中 弃去 25 μL，A12孔作为 PBS对照。 7.2.4 每孔加 25 μL PBS 。 7.2.5 吸取 25 μL 1.0% （体积分数）鸡红细胞悬液，添加至板上 A行的所有孔中。轻扣血凝板混合反 应物，室温（ 20 ℃~25 ℃ ）静置 30 min，环境温度高于 30 ℃时，可在 4 ℃条件下静置 60 min，当对照 孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 7.2.6 结果判定时， 将血凝板倾斜 45°， 观察红细胞有无泪珠状流淌， 完全无泪珠状流淌 （ 100 %凝集） 表明该抗原稀释度可导致红细胞发生完全血凝，导致完全血凝的病毒最高稀释度即 HA效价。例如，当 第8个孔的红细胞发生完全血凝， HA效价为 28，即 1：256。 7.3 HI试验操作步骤 7.3.1 根据 HA试验测定的效价 配制 4个凝集单位（即 4HAU）的抗原 /病毒，示例：抗原 /病毒溶液的 HA效价为 28， 将病毒 /抗原进行 1：256稀释即为 1HAU，4HAU则为将病毒 /抗原溶液进行 1：64稀释。 7.3.2 回滴检查。 配制的 4HAU抗原需经回滴检査血凝 效价是否准确 ，将配制的 4HAU 抗原进行稀 释，使最终稀释度为 1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7。取各个稀释度的4HAU 抗原溶液 25 μL， 加人 PBS 25 μL，再加入1.0 %鸡红细胞悬液 25 μL混匀。将血凝板在室温（ 20 ℃ ~ 25 ℃）静置 30 min 或4 ℃ 60 min ，如果配制的抗原液为 4 HAU，则1：4稀释度将出现凝集终点 ；如果高于 4HAU，可能 1：5或1：6为终点：如果低于 4HAU，可能 1：2或1：3 为终点。 4HAU抗原应根据回滴检测结果调 整准确。 7.3.3 在血凝板的第 2孔 ~ 第11孔加入 25 μL PBS，第 12孔加入 50 μL PBS。 7.3.4 第1孔加入 50 μL经7.1前处理后的血清， 从第 1孔中吸取 25 μL血清， 从第1孔连续转移至 第 10孔，进行 2倍梯度稀释。从 10号孔中弃去 25 μL，第 11孔为抗原对照， 第12孔为 PBS空白对照。 7.3.5 第1孔 ~ 第11孔均加入 25 μL 4HAU 抗原， 在室温 （ 20 ℃ ~ 25 ℃） 静置 30 min或4 ℃ 60 min 。 7.3.6 每孔加入 25 μL 1 .0%（体积分数） 鸡红细胞悬液， 震荡混匀， 在室温 （ 20 ℃ ~ 25 ℃） 静置 30 min 或4 ℃ 60 min 。空白对照孔（第 12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 7.4 结果判定 7.4.1 结果成立的条件 将血凝板倾斜 45°，当抗原对照（第 11孔）完全凝集，且已知禽流感抗体阳性血清与抗原反应后， 出现预期的 HI效价，阴性血清与抗原反应