ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 283—2025 牛分枝杆菌γ干扰素磁微粒化学发光检测 方法 Chemiluminescent detection method of magnetic microparticles for detecting bovine tuberculosis of interferon -γ 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 283—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 禾旭（郑州）生物技术有限公司 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位 ：禾旭（郑州）生物技术有限公司、扬州大学 。 本文件主要起草人 ：任雪建、李秀梅、陈祥、刘近、吕园园、乔宏兴、 徐正中、郑成坤、杨转、 杨 志、陶飞飞、杨红、刘明瑞、殷笑丹、赵小月、杨文慧、李亚静、阴思晴 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 283—2025 1 牛分枝杆菌 γ干扰素 磁微粒化学发光抗体检测方法 1 范围 本文件规定了牛 分枝杆菌 γ 干扰素磁微粒化学发光检测方法 的试剂与耗材、器材与设备、样本采 集及处理、操作步骤、试验成立条件和结果判定标准等内容。 本文件适用于牛结核病的早期诊断、检疫、监测、流行病调查评估等工作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛分枝杆菌 mycobacterium varbovis 旧称牛型结核分枝杆菌，是引起牛结核病的病原。 3.2 反应杯 reaction cup 化学发光免疫分析仪 配套使用的反应容器。 3.3 示踪物 tracer 吖啶酯标记的牛分枝杆菌 γ 干扰素单克隆抗体。 3.4 激发液 stimulate solution 激发液由激发液 A和激发液 B组成，与化学发光免疫试剂配合使用，是一种辅助试剂，为发光过程 提供碱性环境使用 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 283—2025 2 3.5 血细胞刺激物 blood ce ll stimulant 包含 PBS、提纯牛型结核菌素 和提纯禽型结核菌素，用于刺激血液中感染过结核的牛产生 γ 干扰 素，并判断刺激产生源。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 A-PPD：禽型结核菌素（ Avian Tuberculin PPD ） B-PPD：牛型结合菌素（ Bovine Tuberculin PPD ） EDC：1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基 )碳酰二亚胺（ 1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide ） MES：2-吗啉乙磺酸（ 2-Morpholinoethanesulphonic acid ） NHS：N-羟基琥珀酰亚胺（ N-Hydroxysuccinimide ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer saline ） PPD：提纯结核菌素（ purified protein derivative ） 5 技术原理 感染牛分枝杆菌的阳性牛，其外周血淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆， 当体外遇到牛 分枝杆菌特异性抗 原（牛结核菌素刺激时），淋巴细胞将被激活，发生再次细胞免疫反应，释放 大量 γ 干扰素，通过 磁微粒化学发光 免疫检测（双抗夹心 法）技术检测结核 病牛血清中 γ 干扰素。将待测样 本、牛 γ 干扰素 4E8 单抗包被的磁性微球溶液以及吖 啶酯标记的牛 γ 干扰素 2G5 单抗结合物混合； 温育一段时间洗涤后，加入激发液；在碱性条件下，吖啶酯分子的 发射光强度达到最大，通过测量的发 光值结果和既定的判定方法判定待测样本的阴阳性。 禽分枝杆菌属于非结核分枝杆菌，以禽 型结核菌素 刺激淋巴细胞作为对照，可有效排除环境分枝杆菌导致的非特异性反应。 6 试剂与耗材 6.1 血细胞刺激物，制备方法见附录 A。 6.2 磁性微球溶液，制备方法见附录 B。 6.3 示踪物，制备方法见附录 C。 6.4 阴性对照和阳性对照 ，制备方法见附录 D。 6.5 其他相关试剂，制备方法见附录 E。 7 器材与设备 7.1 Ⅱ级生物安全柜。 7.2 恒温培养箱。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 283—2025 3 7.3 全自动化学发光免疫分析仪。 7.4 2 ℃ ~ 8 ℃ 冰箱， -20 ℃ 冰箱。 7.5 5 mL一次性注射器。 7.6 5 mL含肝素钠抗凝剂的一次性采血管。 7.7 2 mL无菌离心管。 7.8 反应杯。 8 检测前准备 8.1 样品采集 及处理 8.1.1 进行静脉无菌采血，每头 5 mL，立即转移至含肝素钠抗凝剂的一次性采血管中，缓慢颠倒 3次 使血液与抗凝剂混匀，然后放入 37 ℃ 保温盒，在 6 h 内送达实验室进行刺激培养。样品收集过程应防 止样品污染，注意个人生物安全防护。 8.1.2 将每支采血管中的抗凝血分别加入到 3个2 mL无菌离心管中，每管 1.5 mL，分别标记为 PBS、 B-PPD、A-PPD管。向标记管中相应加入 100 μL 的PBS、B-PPD和A-PPD，盖严。轻摇使血液与加入 的刺激物充分混合， 在 37 ℃ 恒温培养箱中静置培养 16 h。 收集细胞培养上清， 立即用于牛分枝杆菌 γ 干扰素的检测。 8.2 样本的保存 收集的细胞培养上清样本应立即检测。若暂时不检测，应置于 -20 ℃ 保存待检，避免反复冻融。 注：按照 NY/T 541 要求进行样本的保存。 实验室生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 9 操作步骤 9.1 分别将 50 μL的样本、 阴性对照和阳性对照加至相应反应杯中， 再分别加入 50 μL 磁性微球溶液， 混匀后， 37 ℃ 反应 15 min。 9.2 在各反应杯中加入 300 μL洗涤液，清洗 3 次。 9.3 在反应杯中加 入100 μL结合物，混匀后， 37 ℃ 温育 10 min。 9.4 重复步骤 9.2后分别加入 100 μL激发液 A 和100 μL激发液 B。 9.5 在化学发光免疫分析仪中自动测定各反应杯发光值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 阴性对照发光值与阳性对照发光值之比 ≥10，实验成立。 10.2 试验结果判定 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 283—2025 4 10.2.1 阴性 如出现以下情况判定为阴性： （1）B-PPD 培养上清发光值 -PBS 培养上清发光值＜ 3000 ； （2） B-PPD 培养上清发光值 -PBS 培养上清发光值 ≥3000且 B-PPD 培养上清发光值 -A-PPD 培 养上清发光值＜ 3000，样本判定为牛分枝杆菌 γ 干扰素阴性。 10.2.2 阳性 B-PPD 培养上清发光值 -PBS 培养上清发光值 ≥3000，且 B-PPD 培养上清发光值 -A-PPD 培养上 清发光值 ≥3000，样本判定为牛分枝杆菌 γ 干扰素阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台