ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 282—2025 布鲁氏菌病磁微粒化学发光抗体检测方法 Magnetic particle chemiluminescence method for detection of antibody against brucellosis 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 282—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 禾旭（郑州）生物技术有限公司 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位 ：禾旭（郑州）生物技术有限公司、内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心、大连 市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人 ：任雪建、李秀梅、刘近、乔宏兴、吕园园、夏志明、特木尔巴根、刘佳、郭宇、 杨志、陶飞飞、杨转、赵协、李亚静、刘明瑞、殷笑丹、赵小月、阴思晴、秀英、牧仁、苍真伟、徐林 海、高顺平、特木热、权怀忠、刘海成。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 282—2025 1 布鲁氏菌病磁微粒化学发光抗体检测方法 1 范围 本文件规定了 布鲁氏菌病磁微粒化学发光抗体检测方法 的试剂与耗材、器材与设备、 样本采集及处 理、操作步骤、试验成立条件和结果判定标准等内容。 本文件适用于动物血清中光滑型布鲁氏菌抗体的检测，适用于布鲁氏菌病的血清学监测、流行病学 调查等工作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 反应杯 reaction cup 化学发光免疫分析仪 配套使用的反应容器。 3.2 示踪物 tracer 吖啶酯标记的布鲁氏菌 LPS单克隆抗体 。 3.3 激发液 stimulate solution 激发液由激发液 A和激发液 B组成，与化学发光免疫试剂配合使用，是一种辅助试剂，为发光过程 提供碱性环境使用 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 282—2025 2 EDC：1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基 )碳酰二亚胺（ 1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide ） LPS：脂多糖（ lipopolysaccharides ） MES：2-吗啉乙磺酸（ 2-Morpholinoethanesulphonic acid ） NHS：N-羟基琥珀酰亚胺（ N-Hydroxysuccinimide ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer saline ） 5 技术原理 采用磁微粒化学发光竞争 ELISA 检测技术检测布鲁氏菌抗体。将待测样本、布鲁氏菌 LPS 抗原 包被的磁性微球溶液 加入反应杯中混匀反应，洗涤再加入 吖啶酯标记的布鲁氏菌抗体 ，温育一段时间洗 涤后，加入激发液；在碱性条件下，吖啶酯分子的发射光强度达到最大，通过测量的发光值结果和既定 的判定方法判定待测样本的阴阳性。 6 试剂与耗材 6.1 磁性微球溶液，制备方法见附录 A。 6.2 示踪物，制备方法见附录 B。 6.3 阴性对照和阳性对照 ，制备方法见附录 C。 6.4 激发液 A，制备方法见附录 D中D.1。 6.5 激发液 B，制备方法见附录 D.2。 6.6 浓缩洗涤液，制备方法见附录 D.3。 7 器材与设备 7.1 最大离心 力为 12 000 g的离心机。 7.2 全自动化 学发光免疫分析仪。 7.3 2 ℃ ~ 8 ℃ 冰箱， -20 ℃ 冰箱。 7.4 规格为 5 mL 和 10 mL 的一次性采血器。 7.5 1.5 mL无菌离心管 。 7.6 反应杯。 8 检测前准备 8.1 样品采集 及处理 8.1.1 进行静脉无菌采血，不少于 2 mL。采集静脉血时，每只动物使用一个采血器。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 282—2025 3 8.1.2 将血液室温（ 15 ℃ ~ 25 ℃ ）静置于斜面 2 h ~ 4 h，待血液自然凝固后，置 2 ℃ ~ 8 ℃ 冰箱中 放置不少于 2 h，4000 g离心 10 min。 8.1.3 小心吸出上层血清保存备用。血清应清亮，无溶血、无污染。 8.2 血清样本的保存与运输 8.2.1 血清样本若在一周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存。若超过一周检测，应置于 -20 ℃ 以 下冷冻保存，避免反复冻融。 8.2.2 运输时注意冷藏，采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，在 24 h 内完成样 本运输。 注：按照 NY/T 541 要求进行样本的保存。 实验室生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 9 操作步骤 9.1 将样本、阴性对照、阳性对照分别各加 50 μL 至相应反应杯中，再分别加入 50 μL 磁性微球溶 液，混匀后， 37 ℃ 反应 15 min。 9.2 在各反应杯中加入 300 μL 洗涤液，清洗 3 次。 9.3 在反应杯中加入结 合物 100 uL，混匀后， 37 ℃ 温育 5 min。 9.4 重复步骤 9.2 后分别加入 100 μL 激发液 A 和 100 μL 激发液 B 。 9.5 在化学发 光免疫分析仪中自动测定各反应杯发光值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 阴性对照发光值与阳性对照发光值之比 ≥10，实验成立。 10.2 试验成立条件 10.2.1 阴性 样本与阴性对照发光值 之比＞0.5，样本判定为 布鲁氏菌抗体 阴性。 10.2.2 阳性 样本与阴性对照发光值 之比≤0.5，样本判定为 布鲁氏菌抗体 阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 282—2025 4 附 录 A （规范性） 磁性微球溶液 A.1 取 0.3 mg 牛种布鲁氏菌 LPS 抗原，装入透析袋中，置 PBS 中室温（ 15 ℃ ~ 25 ℃）透析 4 h。 A.2 磁珠洗涤 ：取 10 mg 羧基磁珠到离心管中，固定到磁力架上进行磁分离（或 10 000 g离心 5 m in） ，移除上清。向磁珠中加入 1 mL 的 MES 溶液，振荡分散均匀后，磁分离（或 10 000 g 离心 5 min）移除上清。重复用 MES 溶液磁分离洗涤 2 次，用 0.5 mL MES 溶液重悬。 A.3 磁珠活化 ：向羧基磁珠重悬液中加入 250 μL 的 NHS 溶液，振荡分散均匀，再加入 125 μL 的 EDC溶液，摇匀后固定在混匀器上室温（ 15 ℃ ~ 25 ℃）反应 30 min。反应结束后，磁分离，移除 上清，用 MES 溶液磁分离洗涤 2 次。 A.4 抗原偶联 ：上述磁珠用 800 μL 的 MEST 溶液分散，加入透析后的抗原溶液，补加 MEST 溶液 至总体积 1 mL，摇匀后固定在混匀器上室温（ 15 ℃ ~ 25 ℃）反应 4 h。反应结束后，磁分离，移 除上清，用封闭液磁分离洗涤 2 次。收集每次洗涤的上清液。 A.5 封闭：加入 1 mL的封闭液，振荡分散均匀后，固定在混匀器上反应 4 h。 A.6 稀释：离心，移除上清，用 PBST 磁分离洗涤 3 次，加入 500 mL 的 PBST 重悬偶联后的磁 珠， 2 ℃ ~ 8 ℃ 保存备用。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台