ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 280—2025 山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光 PCR 检测方法 Detection method of universal fluorescent PCR for goat pox virus and sheep pox virus 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 280—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由 中国海关科学技术研究中心 提出。 本标准由中国兽医协会归口。 本标准起草单位： 中国海关科学技术研究中心、沈阳海关技术中心、河南国际旅行卫生保健中心和 大连旅顺文化旅游集团有限公司 。 本标准主要起草人： 耿庆华、史喜菊、徐超、刘学森、啜微微、李成镛。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 280—2025 1 山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光 PCR检测方法。 本文件适用于山羊痘和绵羊痘病毒的检测及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 3186 羊冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应（ Fluorescent polymerase chain reaction ） Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（ Cycle threshold ） GPTV：山羊痘病毒 （Goat pox virus ） SPPV：绵羊痘病毒（ Sheep pox virus ） 5 仪器与设备 5.1 荧光 PCR检测仪。 5.2 高速台式冷冻离心机：可控温至 4℃、离心速度可达 12000 r/min 以上。 5.3 生物安全柜。 5.4 组织研磨器。 5.5 普通冰箱。 5.6 超低温冰箱：可控温至 -70℃。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 280—2025 2 5.7 可调单道 移液器（ 0.2 μL ~ 2 μL、1 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL、20 μL ~ 200 μL和100 μL ~ 1000 μL）。 5.8 高压灭菌锅。 6 试剂和耗材 6.1 试剂 6.1.1 商品化 DNA抽提试剂 盒，于 4 ℃ ~ 8 ℃保存。 6.1.2 无水乙醇， -20 ℃预冷。 6.1.3 75 %乙醇，无水乙醇和双蒸水配制， -20 ℃预冷。 6.1.4 8 mM NaOH 溶液，配制见附录 A。 6.1.5 PBS缓冲液， 0.01 mol/L PBS ， pH 7.4，配制见附录 A。 6.1.6 2× Real -time PCR 预混液， -20 ℃保存，或按照商品化试剂说明书要求保存。 6.1.7 1.5 mL 离心管。 6.1.8 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管。 6.2 阳性对照 山羊痘和绵羊痘病毒阳性对照样品： 采用商品化山羊痘或绵羊痘病毒疫苗或接种了山羊痘和绵羊痘 病毒的细胞悬液或者含有山羊痘和绵羊痘病毒目的基因的核酸 （阳性对照核酸序列见附录 B）。 6.3 阴性对照 山羊痘和绵羊痘病毒阴性对照样品：采用绵羊羔睾丸细胞悬液或健康羊肉组织 。 6.4 引物和探针序列 引物和 TaqMan探针序列见附录 C。 7 样品采集和处理 7.1 采样工具 手术刀、剪刀、镊子，研钵等，经 160 ℃干热灭菌 2 h。一次性无菌采样拭子，真空采血管，记号 笔，低温保藏箱。 7.2 样品采集 7.2.1 血清样本采集：用无菌注射器抽取受检山羊或绵羊静脉血不少于 5mL，置于无菌离心管内，室 温或者 37 ℃倾斜放置自然凝集 20 min ~ 30 min，2000 r/min ~ 3000 r/min 离心 10 min， 吸取上清液 200 μL 到新的离心管内备用。 7.2.2 精液样品采集：按照 NY/T 3186 的方法采集和保存精液。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 280—2025 3 7.2.3 鼻拭子采集：用棉拭子取受检山羊或绵羊鼻腔分泌物，置于 2 mL PBS缓冲液中备用。 7.2.4 组织样本采集：取活体或剖检羊的皮肤丘疹置于 PBS缓冲液中备用。 7.2.5 细胞培养物：待出现 80 %以上细胞病变时，将整瓶细胞冻在 -80 ℃备用。 7.3 样品送检 上述采集的样本可立即用于检测，样本在 2 ℃ ~ 8 ℃下保存应不超过 24 h，-20 ℃ ± 0.5 ℃可以稳定 保存 3个月，长期保存请置于 -70 ℃以下。样本运送采用低温保藏箱或泡沫箱加生物冰袋密封进行运输， 并符合 NY/T 541 和《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》的 相关要求。 7.4 样品处理 7.4.1 血清和精液样本无需进行前处理，直接用于核酸提取。 7.4.2 鼻拭子样本： 充分涡旋震荡含有鼻拭子的管子 1 min ~ 3 min，2000 r/min 离心 5 min， 取出 200 μL 上清，用于后续的核酸提取。 7.4.3 组织样本： 取 1g解冻的组织， 剪碎， 加入 2 mL PBS 缓冲液进行研磨， 制备组织匀浆， 8000 r/min 离心 5 min，取上清 200 μL，用于后续的核酸提取。 7.4.4 细胞培养物：将细胞培养物反复冻融 3次，解冻期间，间隔 5 min，摇晃十 次细胞培养瓶，第 3 次解冻后，将细胞培养物置于灭菌离心管内， 4000 r/min，4 ℃离心 10 min，取上清 200 μL，用于后续 的核酸提取。 8 操作方法 8.1 实验室要求 开展山羊痘和绵羊痘病毒荧光 PCR检测的实验室 应分为三个相对独立的工作区域：核酸提取区、试 剂配制区和检测区。工作区域间应有明确的标识，每一个区域应有专用的仪器设备，避免不同区域的设 备、物品共用。 8.2 DNA提取 8.2.1 DNA提取使用 DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒提取，在核酸提取区操作。 8.2.2 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管， 其中 n 为待检样品数 、阳性对照 数和阴性对照 数之和， 对 每个离心管进行编号。 8.2.3 每管加入 800 μL DNAzol ，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL，颠倒 10 次混 匀， 4 ℃ 或室温 10 000 r/min 离心 10 min。 8.2.4 取 900 μL上清， 置新的 1.5 mL 灭菌离心管中， 加入 500 μL无水乙醇， 混匀， 室温放置 3 min； 4 ℃ 或室温 10000 r/min离心 5 min。 8.2.5 弃上清， 沿管壁缓缓加入 0.8 mL ~ 1 mL 75 %乙醇， 颠倒 3 ~ 6次混匀， 4 ℃ 10000 r/min 离心 5 min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 280—2025 4 8.2.6 用30 μL的8 mM NaOH 溶液溶解沉淀， DNA在4 ℃冰箱可稳定保存数月 ，-20 ℃冰箱可长期 保存。 8.3 荧光PCR检测 8.3.1 反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光 PCR反应管数为 n，n为待检样品数 、阳性对照数和阴性对照数之 和，每个反应的体系见附录 D.1，为了避免移液器取样损失，建议按 n+1个反应进行配制。配制反应液 在冰盒中进行。 8.3.2 反应液的分装 将8.3.1中配制的荧光 PCR反应液充分混匀，按照每管 20 μL分装于 0.2 mLPCR 管内，将 PCR管置于 96 孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。 8.3.3 加样 在核酸提取 区进行。在每个 PCR反应管内加入 8.2制备的 5 μLDNA核酸溶液， 盖上盖子， 500 r/min ~ 1000 r/min离心 30 s。转移至检测区。 8.3.