ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 279—2025 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型三重荧光 PCR检测方法 Triplex real time PCR detection method for porcine pseudorabies virus , porcine parvovirus and porcine circovirus type 2 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 279—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由 中国海关科学技术研究中心 提出。 本标准由中国兽医协会归口。 本标准起草单位： 中国海关科学技术研究中心 、沈阳海关技术中心 、中国动物 疫病预防控制中心 、 成都海关技术中心 、长沙海关技术中心 。 本标准主要起草人： 杜思乐、史喜菊、王素秋、徐立伟、 任彤、赵相鹏、白子龙、周智、 高志强、 耿庆华、林华、汪琳、 张伟、蒲静、张小寒、邓丛良、刘全国、禹思宇 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 279—2025 1 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型三重荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型三重荧光 PCR检测方法操作规程。 本文件适用于猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒 2型的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ：黑洞淬灭基团（ Black Hole Quencher ） Cy5：花青素 5（Cyanine5 ） DEPC：焦碳酸二乙酯（ Diethyl pyrocarbonate ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-Carboxyfluorescein ） HEX：六氯 -6-甲基荧光素（ 6-Hexachlorofluorescein ） PCV -2：猪圆环病毒 2型（ Porcine Circovirus type 2 ） PRV：猪伪狂犬病毒（ Porcine Pseudorabies Virus ） PPV：猪细小病毒（ Porcine Parvovirus ） 5 仪器与设备 5.1 多通道荧光 PCR仪。 5.2 生物安全柜 。 5.3 冰箱（ 2 ℃ ~ 6 ℃和﹣ 20 ℃）。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 279—2025 2 5.4 台式冷冻离心机 。 5.5 组织匀浆机 。 5.6 水浴锅或金属浴仪 。 5.7 漩涡器。 5.8 可调单道 移液器（ 0.2 μL ~ 2 μL、1 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL、20 μL ~ 200 μL和100 μL ~ 1000 μL）。 6 试剂和耗材 6.1 试剂 6.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸 酶的容器分装。 6.1.2 商品化病毒总核酸提取试剂盒或其他病毒核酸提取试剂 。 6.1.3 多重荧光定量 PCR试剂。 6.1.4 无水乙醇。 6.1.5 75 %乙醇。 6.2 阳性对照 含猪伪狂犬病毒（ PRV）gE基因的体外重组质粒、含猪细小病毒（ PPV）NS1基因的体外重组质 粒、含猪圆环病毒 2型（ PCV -2）ORF2基因的体外重组质粒，序列片段序列见附录 A。也可以使用其 他经过确认的阳性质控品。 6.3 阴性对照 猪伪狂犬病毒阴性样品、猪细小病毒阴性样品和猪圆环病毒 2型阴性样品。 6.4 引物和探针序列 引物和探针序列见附录 B。 7 生物安全要求 样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照 GB 19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物 安全柜中进行，并做好个人防护 。 8 样品采集和处理 样品采集和处理应按照 NY/T 541有关规定进行，可以采集动物血液、组织 、鼻拭子和肛拭子 等。 9 病毒核酸提取 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 279—2025 3 病毒核酸提取见附录 C。 10 荧光 PCR反应 10.1 荧光 PCR反应体系 多重荧光 PCR反应体系组成 见附录 D.1。单重荧光 PCR反应体系组成见附录 D.2。 10.2 荧光PCR反应程序 荧光 PCR反应程序见附录 D.3。 10.3 结果描述及判定 10.3.1 试验成立条件 所有阳性对照（ FAM、Cy5和HEX）均出现 S形扩增曲线且 Ct≤30，阴性对照和空白对照（ FAM、 Cy5和HEX）均无扩增曲线且 Ct≥40或者无值。满足此条件，视为此次试验有效。 10.3.2 结果判定和鉴别 10.3.2.1 有典型扩增曲线且 Ct≤35，判定为核酸检测阳性； 10.3.2.2 有典型扩增曲线，但 35 < Ct < 40，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单荧光 PCR方 法确认；如果 Ct值仍然 < 40，则判定为核酸检测阳性，如果 Ct值≥40或者无 Ct值，判定为核酸检测 阴性。 10.3.2.3 没有扩增曲线，或者 Ct≥40，判定核酸检测阴性。 10.3.2.4 FAM阳性荧光信号表示 PCV -2核酸检测阳性， Cy5阳性荧光信号表示 PRV核酸检测阳性， HEX阳性荧光信号表示 PPV核酸检测阳性； 两种阳性荧光信号表示对应的其中两种病毒核酸检测阳性， 三种阳性荧光信号表示 PCV -2、PRV和PPV三种病毒核酸检测阳性，结果鉴别见表 1。 表1 结果鉴别 荧光信号阴阳性 病毒核酸检测结果 FAM（﹢） PCV -2核酸检测阳性 Cy5（﹢） PRV核酸检测阳性 HEX（﹢） PPV核酸检测阳性 FAM（﹢） Cy5（﹢） PCV -2和PRV核酸检测阳性 FAM（﹢） HEX（﹢） PCV -2和PPV核酸检测阳性 Cy5（﹢） HEX（﹢） PRV和PPV核酸检测阳性 FAM（﹢） Cy5（﹢） HEX（﹢） PCV -2、PRV和PPV核酸检测阳性 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 279—2025 4 附 录 A （资料性） 病原基因参考序列 A.1 PRV-gE基因参考序列（ GenBank Accession No.OP879553.1 ） 5‘-GGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGT GTTCTTTGTGGCGGTGGGCGACCGGCCGCCGCCGGCGGACCCGGTGGGCCCCGCGCGCCACGAG CCCCGCTTCCACGCGCTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGACACGTTCGACCTGATG CCGCGCGTGGTCTCGGACATGGGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGACTGGTACTA CGCGCGCGCGCCCCCG CGGTGCCTGCTGTACTACG TGTA CGAGCCCTGCATCTACCACC CGCGC GCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGCG TGCAGCTTCACCTCGCC GGCGCGCGCGCGG CTGGTGGCGCGCCG -3＇ 注：下划线部分为连入 pMD -18T载体的 PRV -gE基因目标检测片段，黑体为引物序列，斜体为探针序列。 A.2 PPV-NS1基因参考序列（ GenBank Accession No.AY583318.1 ） 5‘-AAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATAAACCTAACCAGA AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGT AAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGG TCAGAA