ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 278—2025 猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼 吸综合征病毒三重荧光 RT-PCR检测方法 Triplex real time RT -PCR detection method for Swine influenza virus 、 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2025 - 8 - 13发布 2025 - 8 - 13实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 278—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由 中国海关科学技术研究中心 提出。 本标准由中国兽医协会归口。 本标准起草单位： 中国海关科学技术研究中心 、中国动物 疫病预防控制中心 、成都海关技术中心 、 沈阳海关技术中心 、长沙海关技术中心 。 本标准主要起草人： 王素秋、史喜菊、白子龙、杜思乐、周智、 高志强、耿庆华、林华、汪琳、 张 伟、蒲静、 赵相鹏、张小寒、邓丛良、刘全国、徐立伟、禹思宇 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 278—2025 1 猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光 RT-PCR检测方法操 作规程。 本文件适用于猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ：黑洞淬灭基团（ Black Hole Quencher ） Cy5：花青素 5（Cyanine5 ） DEPC：焦碳酸二乙酯（ Diethyl pyrocarbonate ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-Carboxyfluorescein ） HEX：六氯 -6-甲基荧光素（ 6-Hexachlorofluorescein ） PRRSV -EU：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒（ European Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus ） PRRSV -NA：北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒 （ North American Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus ） SIV：猪流感病毒（ Swine Influenza Virus ） 5 仪器与设备 5.1 多通道荧光 PCR仪。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 278—2025 2 5.2 生物安全柜 。 5.3 冰箱（ 2 ℃ ~ 6 ℃和﹣ 20 ℃）。 5.4 台式冷冻离心机 。 5.5 组织匀浆机 。 5.6 水浴锅或金属浴仪 。 5.7 漩涡器。 5.8 可调单道 移液器（ 0.2 μL ~ 2 μL、1 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL、20 μL ~ 200 μL和100 μL ~ 1000 μL）。 6 试剂和耗材 6.1 试剂 6.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸 酶的容器分装。 6.1.2 商品化病毒总核酸提取试剂盒或其他病毒核酸提取试剂 。 6.1.3 商品化荧光 RT-PCR试剂盒：含一步法荧光 RT-PCR反应混合液，反转录酶、 DNA聚合酶等。 6.1.4 无水乙醇。 6.1.5 75 %乙醇。 6.2 阳性对照 猪流感病毒体外转录的非感染性 RNA片段、北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒体外转录的 非感染性 RNA片段，片段序列见附录 A。也可以使用其他经过确认的阳性质控品 。 6.3 阴性对照 猪流感病毒阴性样品、北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样品 。 6.4 引物和探针序列 引物和探针序列见附录 B。 7 生物安全要求 样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照 GB 19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物 安全柜中进行，并做好个人防护 。 8 样品采集和处理 病料采集和处理应按照 NY/T 541有关规定进行，可以采集动物血液、组织 、鼻拭子和肛拭子 等。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 278—2025 3 9 病毒核酸提取 病毒核酸提取见附录 C。 9.1 样品采集 按照 NY/T 541规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于 2 mL，用自然析出法分 离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。 9.2 血清样品的保存与运输 按照 NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置 2 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存。若超过一周 检测，置于 - 20 ℃以下冷冻保存。 10 荧光 RT-PCR反应 10.1 荧光 RT-PCR反应体系 多重荧光 RT-PCR反应体系组成 见附录 D.1。单重荧光 RT-PCR反应体系组成见附录 D.2。 10.2 荧光RT-PCR反应程序 荧光 RT-PCR反应程序见附录 D.3。 10.3 结果描述及判定 10.3.1 试验成立条件 所有阳性对照（ FAM、Cy5和HEX）均出现 S形扩增曲线且 Ct值≤30，阴性对照和空白对照（ FAM、 Cy5和HEX）均无扩增曲线且 Ct≥40或者无值。满足此条件，视为此次试验有效。 10.3.2 结果判定和鉴别 10.3.2.1 有典型扩增曲线且 Ct≤35，判定为核酸检测阳性； 10.3.2.2 有扩增曲线但 35 < Ct < 40 ，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单重荧光 RT-PCR方 法确认；如果 Ct值仍然 < 40，则判定为核酸检测阳性，如果 Ct值≥40或者无 Ct值，判定为核酸检测 阴性。 10.3.2.3 没有扩增曲线，或者 Ct≥40，判定为核酸检测阴性。 10.3.2.4 FAM阳性荧光信号表示 PRRSV -NA核酸检测阳性， Cy5阳性荧光信号表示 SIV核酸检测阳 性， HEX阳性荧光信号表示 PRRSV -EU核酸检测阳性；两种阳性荧光信号表示对应的其中两种病毒核 酸检测阳性，三种阳性荧光信号表示 SIV、PRRSV -NA和PRRSV -EU三种病毒核酸检测阳性，结果鉴 别见表 1。 表1 结果鉴别 荧光信号阴阳性 病毒核酸检测结果 FAM（﹢） PRRSV -NA核酸检测阳性 Cy5（﹢） SIV核酸检测阳性 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 278—2025 4 HEX（﹢） PRRSV -EU核酸检测阳性 FAM（﹢）Cy5（﹢） PRRSV -NA和SIV核酸检测阳性 FAM（﹢）HEX（﹢） PRRSV -NA和PRRSV -EU核酸检测阳性 Cy5（﹢）HEX（﹢） SIV和PRRSV -EU核酸检测阳性 FAM（﹢）Cy5（﹢）HEX（﹢） PRRSV -NA、SIV和PRRSV -EU核酸检测阳性 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台