ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 274—2025 实验动物 鼠棒状杆菌 荧光PCR检测方法 Laboratory animal -qPCR for detection of Corynebacterium kutscheri 2025 - 7 - 17发布 2025 - 7 - 17实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 274—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提出 。 本文件由 中国兽医协会归口。 本文件起草单位 ：江苏集萃药康生物科技股份有限公司 、上海实验动物研究中心 、苏州大学苏州医 学院实验动物中心、 苏州西山生物技术有限公司 、广东省医学实验动物中心、广东药康生物科技有限公 司。 本文件主要起草人：赵静、魏晓锋、 周正宇、 王晨娟、陈傍柱、王韬、杨慧欣、李灵恩、蔡利东、 田苗苗、于灵芝、盛雅洁、王立鹏、郑佳琳 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 274—2025 1 实验动物 鼠棒状杆菌 荧光PCR检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物鼠棒状杆菌的 荧光 PCR检测方法。 本文件适用于实验大鼠、小鼠的鼠棒状杆菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.42 实验动物 细菌学检测 标本采集 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件无需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ：无荧光淬灭基团（ Black hole quencher ） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribon ucleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylenediamine tetraacetic acid ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-Carboxyfluorescein ） gyrB：促旋酶 B亚单位蛋白（ Gyrase subunit B ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸缓冲液（ Tris-acetate -EDTA） 5 原理 针对鼠棒状杆菌 (Corynebacterium kutscheri ，C. kutscheri )的gyrB保守基因靶点基因设计特异性引 物和探针序列，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基因发 射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发荧光； PCR扩增时， Taq酶的 5′→3′外切酶将探针酶切降解，使 报告荧光基团和淬灭基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器捕捉。随着 PCR反应的循 环进行， PCR产物与荧光信号的增强呈对应关系。因此，可以通过测定荧光信号强度分析样品中是否 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 274—2025 2 含有鼠棒状杆菌核酸，以判断鼠棒状杆菌感染情况。 6 实验材料 6.1 试剂 6.1.1 除特殊说明外，本文件所用试剂均为分析纯；所用水应符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均用 无核酸酶的容器分装。 6.1.2 DNA提取试剂： 细菌 DNA提取试剂盒或其他等效产品。 6.1.3 实时荧光 PCR试剂：商品化实时荧光 PCR试剂盒或其他类似及等效产品 。 6.1.4 无菌磷酸盐缓冲液（ PBS）（0.02 mol/L ，pH 7.2），配制方法 按附录 A。 6.2 引物与探针 针对鼠棒状杆菌的特异性靶点基因序列（按附录 B）设计特异性引物、探针，引物、探针序列见附 录C。 6.3 主要设备和耗材 6.3.1 电动匀浆 仪。 6.3.2 0.5 mm无菌氧化锆珠。 6.3.3 高速台式离心机（离心转速可达 13000 r/min ）。 6.3.4 涡旋振荡仪。 6.3.5 分析天平。 6.3.6 微量分光光度计。 6.3.7 高压蒸汽灭菌器。 6.3.8 冰箱（ -20 ℃、-80 ℃） 6.3.9 生物安全柜。 6.3.10 超净工作台。 6.3.11 实时荧光定量 PCR仪。 6.3.12 微量移液器（ 100 μL ~ 1000 μL、20 μL ~ 200 μL、2 μL ~ 20 μL、0.5 μL ~ 10 μL）。 6.3.13 无核酸酶的离心管（ 1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL），无核酸酶的枪头（ 10 μL、200 μL、1 mL）， 无核酸酶的 PCR扩增反应管（ 0.2 mL，八连排或 96孔板）。 6.3.14 采样工具：剪刀、镊子和无菌棉拭子等。 7 实验步骤 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 274—2025 3 7.1 通则 样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 的规定执行；实验室生物安全要求按照 GB 19489 的规定 执行。 7.2 样品的采集 按照 GB/T 14926.42 的方法，无菌采集实验动物 呼吸道分泌物 、肺脏组织， 装入无菌容器中 ，编号 备用。采样过程中避免样品间交叉污染。 7.3 DNA提取 7.3.1 样品预处理 将采集的 呼吸道分泌物棉拭子 浸泡于 2 mL无菌 PBS 溶液，静置 5 min ~ 10 min；涡旋振荡仪 充分振 荡混匀，编号备用。 取0.2g 左右的待检肺脏组织置于无菌研磨管中， 加入 5倍体积的无菌 PBS 溶液和 2颗~ 3颗无菌氧化 锆珠，电动匀浆仪研磨 1 min ~ 2 min。吸取200 μL左右的肺脏组织 匀浆加入 1.5 mL无菌离心管中 ，用于 DNA 提取或置于 -20 ℃保存备用。 7.3.2 核酸提取 使用细菌 DNA提取试剂盒提取样本 DNA，提取方法严格按照选用试剂盒配套的说明书进行。 7.4 荧光PCR扩增 7.4.1 荧光PCR扩增反应体系 荧光 PCR反应体系见表 1。反应液的配制需在冰上操作，每次反应需同时设置阳性对照、阴性对 照和空白对照 。阳性对照以含鼠棒状杆菌的 样品所提核酸、鼠棒状杆菌标准核酸或质粒标准品 作为阳性 对照模板，阴性对照以不含 鼠棒状杆菌 DNA的核酸样品（含 其他细菌 DNA）作为阴性对照模板，空 白对照以无菌去离子水作为 空白对照 模板。 表1 荧光 PCR扩增反应体系配置表 组分 剂量（ μL） 终浓度 2×TaqMan qPCR master mix 10.0 1× 上游引物 CK-F（10 μmol/L） 0.8 400 nmol/L 下游引物 CK-R（10 μmol/L） 0.8 400 nmol/L 荧光探针 CK-P（10 μmol/L） 0.8 400 nmol/L DNA模板 2.0 / 去离子水 5.6 / 总体系 20.0 / 7.4.2 荧光PCR反应程序 荧光 PCR扩增反应 程序见表 2。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 274—2025 4 表2 荧光 PCR反应程序 反应温度（ ℃） 反应时间 采集荧光信号 循环数 95 5 min - 1 95 30 s - 40 60 30 s 是 注：可使用其他等效的实时荧光 PCR检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可做相应调整。试验检测结束后，根据 收集的荧光曲线和 Ct值判断结果。 7.5 结果判定 7.5.1 结果分析和条件设定 直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴 性样品扩增曲线的最高点为准。 7.5.2 质控标准 7.5.2.1 空白对照无 Ct值，无荧光扩增曲线，扩增曲线为水平线或 Ct值> 40。 7.5.2.2 阴性对照无 Ct值，无荧光扩增曲线，扩增曲线为水平线或 Ct值> 40。 7.5.2.3 阳性对照 Ct值≤35，有标准 “S”形荧光扩增曲线，则表明反应体系运行正常，否则此次试 验无效，需重新进行荧光 PCR扩增。 7.5.3 结果判定 7.5.3.1 质控成立条件下，若待检样本 无Ct值，无荧光扩增曲线，扩增曲线为水平线或 Ct值> 40， 则判定该样品 C. kutscheri 核酸阴性。 7.5.3.2 质控成立条件下，若待检样本有标准 “S”形荧光扩增曲线，且 Ct值≤35时，则判断该 样品 C. kutscheri