ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 272—2025 实验动物 鞭毛虫PCR检测方法 Laboratory animal —PCR for detection of flagellates 2025 - 7 - 17发布 2025 - 7 - 17实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 272—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提出 。 本文件由 中国兽医协会归口。 本文件起草单位 ：江苏集萃药康生物科技股份有限公司 、上海实验动物研究中心、苏州大学苏州医 学院实验动物中心、苏州西山生物技术有限公司、北京药康生物科技有限公司。 本文件主要起草人：赵静、魏晓锋、周正宇、王晨娟、史培良、杨慧欣、王韬、李灵恩、蔡利东、 李乃馨、于灵芝、盛雅洁、王立鹏。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 272—2025 1 实验动物 鞭毛虫PCR检测方法 1 范围 本文件描述了实验动物鞭毛虫的 PCR检测方法。 本文件适用于 实验小鼠、大鼠的鞭毛虫定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18448.10 实验动物 肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylenediamine tetraacetic acid ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase chain reaction ） RNA：核糖核酸（ Ribonucleic acid ） SSU rRNA ：核糖体小亚基 RNA（Small subunit ribosomal RNA ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸缓冲液（ Tris-acetate -EDTA） 16S rRNA ：16S核糖体 RNA（16S ribosomal RNA ） 23S rRNA ：23S核糖体 RNA（23S ribosomal RNA ） 5 原理 用合适的方法提取样本中的鞭毛虫 DNA，针对鞭毛虫 23S rRNA 、SSU rRNA 等特异性靶点基因 设计引物序列，通过 PCR对模板 DNA进行扩增， 根据 PCR检测结果判定该样品中是否含有鞭毛虫的 核酸成分，以判断鞭毛虫感染情况。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 272—2025 2 6 实验材料 6.1 试剂 6.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸 酶的容器分装。 6.1.2 商品化粪便 DNA提取试剂盒或其他等效产品。 6.1.3 PCR反应酶：商品化 DNA聚合酶或其他等效产品。 6.1.4 磷酸盐缓冲液（ PBS）(0.02 mol/L ，pH 7.2)，配制方法按附录 A。 6.1.5 琼脂糖。 6.1.6 50×TAE电泳缓冲液，配制方法按附录 A。 6.1.7 DNA相对分子质量标准： 100 ~ 2000 bp（DL2000 DNA Marker ）。 6.1.8 溴化乙锭（ EB）： 10 mg/mL ，配制方法按附录 A，或其他等效产品。 6.1.9 1.5 %琼脂糖凝胶，配方按附录 A。 6.2 引物 针对鼠六丝鞭毛虫 （Spironucleus muris ）、鼠三毛滴虫 （Tritrichomonas muris ）的特异性靶点基因 序列（见附录 B）设计特异性引物，引物序列见附录 C。 6.3 主要仪器设备和耗材 6.3.1 电动匀浆器。 6.3.2 0.5 mm无菌氧化锆珠子。 6.3.3 恒温水浴锅。 6.3.4 高速台式离心机（离心速度可达 13000 r/min ）。 6.3.5 涡旋振荡仪器。 6.3.6 分析天平。 6.3.7 高压蒸汽灭菌器。 6.3.8 冰箱（-20 ℃、-80 ℃）。 6.3.9 生物安全柜。 6.3.10 超净工作台。 6.3.11 PCR仪。 6.3.12 凝胶电泳仪。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 272—2025 3 6.3.13 微量移液器（ 0.5 μL ~ 10 μL 、2 μL ~ 20 μL、20 μL ~ 200 μL、100 μL ~ 1000 μL）。 6.3.14 无核酸酶的离心管（ 1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL），无核酸酶的枪头（ 10 μL、200 μL、1 mL）， 无核酸酶的 PCR扩增反应管（ 0.2 mL八连排或 96孔板）。 6.3.15 采样工具：剪刀、镊子和无菌棉拭子等。 7 实验步骤 7.1 通则 样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 的规定执行；实验室生物安全要求按照 GB 19489 的规定 执行。 7.2 样品采集 参考 GB/T 18448 .10的方法，无菌采集实验动物盲肠内容物、粪便，每份 40 mg ~ 60 mg，装入无 菌容器中。采样过程中避免样品间交叉污染。采集完成后，编号备用。 7.3 废弃物处理 采样结束后，动物尸体、未使用完的盲肠内容物、粪便样品应使用生物安全垃圾袋包装完整，高压 灭菌后交由医疗垃圾处理单位处理；采样器材应使用消毒液浸泡或高压灭菌消毒，并做好实验台面及采 样时的消毒。 7.4 样品DNA提取 7.4.1 样品预处理 取待检实验动物的新鲜粪便 40 mg置于无菌研磨管中，加入 400 μL无菌 PBS溶液和 3 ~ 5颗无菌氧化 锆珠子， 放入电动匀浆仪中匀浆。 取匀浆后的粪便样本 100 mg ~ 300 mg至1.5 mL无菌离心管中用于 DNA 提取或置于 -20℃保存备用。 7.4.2 核酸提取 利用商品化粪便寄生虫 DNA提取试剂盒或核酸自动提取仪进行样本 DNA的提取，提取方法按照选 用试剂盒配套的说明书进行。 7.5 PCR检测操作程序 7.5.1 PCR扩增反应体系 PCR扩增反应体系见表 1。每次反应需同时设置阳性对照和阴性对照，其中以鞭毛虫 DNA或标准 质粒 DNA作为阳性对照、以不含有鞭毛虫的其它寄生虫 DNA作为阴性对照。 表1 PCR扩增反应体系 组分 1个检测反应的加入量（ μL） 终浓度 2 × Rapid Taq Master Mix 15.0 1× 上游引物 F（10 μmol/L） 0.3 100 nmol/L 下游引物 R（10 μmol/L） 0.3 100 nmol/L 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 272—2025 4 模板 DNA 2 / 去离子水 12.4 / 总体积 30 / 7.5.2 反应程序 PCR扩增反应 程序见表 1。 表2 PCR扩增反应程序 反应温度 （℃） 反应时间 循环数 95 5min 1 95 30 s 35 62 30 s 72 30 s 72 5min 1 注：鼠六丝鞭毛虫、鼠三毛滴虫特异性引物的退火温度 Tm值62℃，延伸时间 30 s。 7.5.3 电泳观察 使用 1× TAE溶液，配制含有溴化乙锭的 1.5 %琼脂糖凝胶。用移液器取 8 μL ~ 10 μL的PCR扩增产物 加入 1.5 %琼脂糖凝胶的梳孔中， 其它孔中分别加入等量的阴性对照、 阳性对照的 PCR产物， 并以 DL2000 DNA Marker 作为参照进行电泳检测。电压根据实际电泳槽长度确定，一般控制在 3 V/cm ~ 5 V/cm，当 看到指示染料移动到凝胶边缘时关闭电源结束电泳。将凝胶放入凝胶成像系统进行拍照记录电泳结果。 7.6 结果判定 7.6.1 试验成立条件 阳性对照出现相应大小 （各引物的扩增产物大小见附录 C） 的目的扩增条带 ，阴性对照未出现条带， 试验结果有效；否则应重新进行试验。 7.6.2 结果判定 7.6.2.1 鼠六丝鞭毛虫特异引物检测被检样本出现 586 bp条带时，判定为鼠六丝鞭毛虫核酸阳性，否 则为鼠六丝鞭毛虫核酸阴性。 7.6.2.2 鼠三毛滴虫特异引物检测被检