ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 271—2025 牛源疣状毛癣菌检验技术规范 Technical specifications for testing Trichophyton verrucosum in Bovine 2025 - 7 - 10发布 2025 - 7 - 10实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 271—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 四川农业大学动物医学院 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 四川农业大学、四川省动物疫病预防控制中心、四川省畜牧科学研究院、广元市 动物疫病预防控制中心、四川水利职业技术学院、 宁夏农林科学院、四川省阳平种牛场、华中农业大学 。 本文件主要起草人： 马晓平、李志国、王娅、左之才、谢跃、陈冬、王之盛、易军、王巍、侯志乾、 张坤、苟丽萍、姜尧章、杨超、郭亚男、郭红瑞、曾伟、谭雄、李青、李健、孙思莉、唐都、庞权、杨 彪、蒋丽春、冯莹、胡长敏 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 271—2025 1 牛源疣状毛癣菌检验技术规范 1 范围 本文件规定了牛源疣状毛癣菌临床诊断、实验室诊断及综合判定的技术要求。 本文件适用于牛源疣状毛癣菌皮肤真菌病的检测和诊断。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 疣状毛癣菌皮肤癣病 Trichophyton verrucosum for bovine dermatophytosis 疣状毛癣菌（ Trichophyton verrucosum ）侵入牛皮肤、黏膜及其附属物 器（毛发、爪等） ，引起牛的 一种感染性疾病，其感染具有人畜共患，小规模 流行的特征。患病动物是本病的传染源，主要因接触而 传染，也可 通过被污染的用具或饲养管理人员等间接接触 途径传染，一年四季均可发生，尤其集中在秋 冬季节。 3.2 初步诊断 preliminary diagnosis 根据患病家畜出现临床症状或病征，通过初步观察、检查和分析，快速判断可能的疾病类型，需通 过病原学检测等科学手段验证。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BPC：溴甲芬紫酪蛋白牛奶肌醇（ Bromophenol Purple Casein Milk Inos itol） DMSO：二甲基亚砜（ Dimethyl sulfoxide ） DTM：皮癣菌鉴别培养基（ Dermatophyte Test Medium ） SDA：沙氏葡萄糖琼脂（ Sabouraud Dextrose Agar ） 5 仪器、材料、试剂和培养基 5.1 仪器 5.1.1 超净工作台。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 271—2025 2 5.1.2 PCR仪。 5.1.3 光学显微镜。 5.1.4 高压蒸汽灭菌锅。 5.1.5 电泳仪。 5.1.6 全自动凝胶成像系统。 5.1.7 培养箱。 5.1.8 微量移液器。 5.1.9 6.00 mm 圆形打孔器 。 5.1.10 直径2 cm，高 0.5 cm环壁带有小孔 的铜环。 5.2 材料 5.2.1 离心管。 5.2.2 手术刀片。 5.2.3 棉球。 5.2.4 培养皿。 5.2.5 载玻片。 5.2.6 盖玻片。 5.2.7 1 mL滴管。 5.2.8 酒精灯。 5.2.9 石蜡。 5.2.10 0.5 mL、1 mL注射器。 5.3 试剂 5.3.1 75 %酒精。 5.3.2 生理盐水 。 5.3.3 蒸馏水。 5.3.4 甘油。 5.3.5 改良复方 KOH溶液制备见附录 A.1。 5.3.6 Goldview 染色剂。 5.3.7 琼脂糖。 5.3.8 棉兰染液 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 271—2025 3 5.4 培养基 5.4.1 SDA培养基配制见附录 A.2。 5.4.2 改良的 SDA培养基配制见附录 A.3。 5.4.3 DTM培养基配制见附录 A.4。 6 临床诊断 6.1 临床症状 牛感染疣状毛癣菌后，病牛表现为瘙痒、环形脱毛及皮肤炎症，病灶多见于头部和躯干侧面。成年 牛和犊均可感染疣状毛癣菌，重症病例可见全身弥漫性脱毛结痂。 6.2 初步诊断 若患病牛只呈现附录 B中规定的局部或全身性感染典型临床症状，应作为初步诊断的判定依据。 7 实验室诊断 7.1 常规检测 7.1.1 样品采集 从发病的牛场选择有典型皮肤真菌病的牛，使用 75%酒精棉球涂擦患部消毒，取无菌手术刀片刮取 病变与健康皮肤组织交界处的皮屑、 痂皮和被毛等病料， 放入无菌的离心管中于 4 ℃ ~ 8 ℃运输与保存。 7.1.2 病料显微镜检查（改良的 KOH法） 取少量病料（皮屑、被毛等），放在清洗干净的载玻片上，用 1 mL滴管滴加改良复方 KOH溶液 1 ~ 2滴，加盖玻片，用滤纸吸净周边溢液，在显微镜下镜检。 结果判断：对同一病料样本进行连续三次重复检测，按照附录 C中C.1的结果，若任一次显微观察 中检出特征性菌丝及孢子形态结构，则判定为阳性；三次重复检测均未观察到上述形态特征者，则判定 为阴性。 7.1.3 病原菌的分离纯化与形态观察 将采集的病料接种于改良的 SDA培养基或皮癣菌鉴别培养基，放入 28 ℃真菌培养箱培养 7 d。对生 长出的真菌菌落，挑取单个菌落于 SDA分离纯化。将分离纯化后得到的菌株置于 SDA培养基 28 ℃培养 7 d ~ 14 d， 然后使用直径为 6.00 mm的圆形打孔器经火焰灼烧除菌冷却后对纯化后培养得到的菌落进行打 孔取菌苔，并将其置于另一个 SDA培养基平板中心， 28 ℃培养 7 d ~ 14 d，观察菌落的表型。 挑取分离株菌落于生理盐水配制成 1× 106 CFU/mL的菌悬液。准备无菌培养皿，放入火焰灼烧灭菌 的载破片，将铜环于酒精灯外焰上灼烧后放入石蜡， 利用石蜡融化产生的粘性将载玻片和铜环固定在一 起，立即取干净盖玻片火焰灼烧灭菌后覆盖，形成密闭空间。用 1 mL的注射器将温度约 50 ℃的SDA培 养基 0.5 mL从小孔中注入后略倾斜，待其冷却凝固后，使用 0.5 mL的注射器将孢子悬液 0.1 mL注入铜环 内的培养基表面，石蜡封铜环侧面小孔。盖上无菌的培养皿盖，放入 28 ℃培养箱中培养， 7 d后小心取 盖玻片上长满的菌丝和孢子经棉兰染色后 ，镜检观察微孢子和菌丝形态。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 271—2025 4 结果判断：当待测菌落呈现附录 C中C.2 ~ C.3规定的典型菌落形态特征及对应菌体形态学特征时， 判定为阳性；未观察到符合上述形态学特征者，则判定为阴性。 7.1.4 理化特性检测 将分离株菌落转种在 BPC培养基上。 结果判断：当出现附录 C中C.4的清楚宽阔的水解带，判定为阳性；未观察到符合上述现象，则判 定为阴性。 7.2 分子生物学检测技术 7.2.1 基因组DNA提取 使用真菌基因组 DNA快速抽提试剂盒提取。 7.2.2 引物合成 参照 GenBank 中疣状毛癣菌 天冬酰胺酶家族蛋白 基因序列设计 特异性引物（预期扩增片段大小 581bp）： 上游引物 F：5’-CAGGGGGGTCCAGGTGTAT -3’ 下游引物 R：5’-CGTTGAGATGGCAAGTGTT -3’ 7.2.3 PCR反应体系和反应程序 PCR反应总体系为 25 µ L，其中包括 Premix Taq （Ex Taq Version 2.0 ）12.5 µ L，上下游引物各 1 µ L， ddH 2O 8.5 µ L，DNA模板 2 µ L。PCR反应程序： 94℃ 10 min ，94℃ 30 s ，55℃ 30 s ，72℃ 70 s 30 次循环 后72℃延伸 5 min。取 5 μL PCR 产物及 5 μL DNA 标准 Marker，加入 1.2%琼脂糖凝胶板的孔内，经 120 V 电泳，电泳 20 min，于紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统中观察结果。 7.2.4 结果判断 待检样本 PCR扩增产物经电泳分析后，显示附录 D中的 581 bp特征性目的条带，则判定为阳性；未 观察到该特异性条带，则判定为阴性 。 8 综合判定 根据 6 ~ 7的临床诊断、常规检测和分子生物学检测结果，可综合判定为牛疣状毛癣菌病。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台