ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 269—2025 鸡球虫虫 种的PCR鉴定技术 PCR identification technique of chicken coccidia species 2025 - 7 - 10发布 2025 - 7 - 10实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 269—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医协会 兽医寄生虫病防治分会 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 南京农业大学、江苏省农业科学院、江苏农牧科技职业学院 、中农华威制药股份 有限公司 。 本文件主要起草人： 宋小凯、李祥瑞、徐立新、严若峰、陆明敏、黄欣梅、刘剑华、蒲响林、莘仕 林，游锡火、曾徐浩、何钦义 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 269—2025 1 鸡球虫虫 种的PCR鉴定技术 1 范围 本文件规定了鉴定公认的 7种鸡球虫虫种的 PCR鉴定技术。 本文件适用于 公认的 7种鸡球虫的鉴定，包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、 布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸡球虫 chicken coccidia 一种专性细胞内寄生原虫，寄生于鸡的肠上皮细胞内，主要危害 3个月以内的雏鸡， 15 ~ 50日龄时 更为严重，除造成死亡外，病愈鸡长期不能康复。卵囊呈圆形、卵圆形或椭圆形。鸡球虫在分类学上属 于原生动物门 （Protozoa）、顶复器门 （ Apicomlexa ） 、 孢子虫纲 （ Sporozoasida ） 、 球虫亚纲 （ Coccidiasina ）、 真球虫目 （ Eucoccidiorida ）、 艾美耳亚目（ Eimeriorina ）、 艾美耳科 （ Eimeriidae ）和艾美耳属 （ Eimeria）。 公认的鸡球虫有 7种，分别为柔嫩艾美耳球虫（ Eimeria tenella ）、毒害艾美耳球虫（ Eimeria nec atrix）、 堆型艾美耳球虫（ Eimeria acervulina ）、布氏艾美耳球虫（ Eimeria brunetti ）、巨型艾美耳球虫（ Eimeria maxima）、和缓艾美耳球虫（ Eimeria mitis ）和早熟艾美耳球虫（ Eimeria praecox ），其孢子化卵囊的 形态如附录 A图A.1所示。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） ITS：内转录间隔区（ internal transcribed spacer ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffered saline ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸（ tris-acetate -EDTA） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 269—2025 2 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器 PCR仪、 4℃高速低温离心机、台式低速离心机、电泳仪、微量移液器、凝胶成像系统。 5.2 主要试剂和材料 DL500 DNA Marker 、2× Taq DNA 聚合酶 Mix、琼脂糖、1×TAE缓冲液、上样缓冲液、 PBS、去离 子水、 SDS裂解液、酚 :氯仿 :异戊醇（ 25:24:1）DNA提取液、异丙醇、 75%无水乙醇、 7种鸡球虫卵囊， 其中 1×TAE缓冲液和 PBS等试剂的配制符合 GB/T 6682 -2008第4.3条的规定。 6 操作步骤 6.1 卵囊的洗涤 取保存于2.5%重铬酸钾 液的待检鸡球虫 卵囊至 15 mL离心管中， 补加 PBS至10 mL，3000 r/min 离心 8 min，弃上清，重复以上操作 3次，显微镜下计数。 6.2 卵囊 DNA的提取 按以下步骤提取鸡球虫基因组 DNA： a) 取经洗涤后的卵囊 2000个至 2 mL离心管， 加入 600 µ L SDS 裂解液和 200 mg直径为 0.4 ~ 0.6 mm玻璃珠，涡旋仪剧烈振荡 10 min，12000 r/min 室温离心 5 min； b) 转移 500 µ L上清液至 1.5 mL离心管， 向其加入等体积酚 :氯仿 :异戊醇 （ 25:24:1）DNA提取液， 剧烈震荡以形成乳浊液， 12000 r/min 室温离心 10 min； c) 转移 300 µ L上清液至 1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇混匀后， -20℃沉淀； d) 4℃，12000 r/min 离心 15 min， 弃上清。 用 75%无水乙醇洗涤 DNA沉淀， 12000 r/min 离心 5 min， 弃上清，并重复洗涤步骤 1次； e) 将1.5 mL离心管室温晾干，向离心管中滴加 20 ~ 50 µ L双蒸水，吹打混匀后测定核酸浓度， -20℃贮存备用； f) 7种鸡球虫卵囊与待检样品同步处理。 6.3 PCR检测 以提取的球虫基因组 DNA为模板，应按照附录 B表B.1所示的 7种鸡球虫的特异性引物和对应退火温 度，分别进行 PCR反应。反应体系如下： 2 × Taq DNA 聚合酶 Mix 12.5 µL，上、下游引物 10 pmol /µL各1 µL，DNA模板 1 µ L，含0.5 ng ~ 0.5 µ g 模板 DNA， 添加双蒸水至 25 µ L。PCR反应程序为 94℃预变性 3 min； 循环反应： 94℃ 45 s ，按照附录 B表B.1所示来设置退火温度，退火 45 s，72℃延伸 45 s，30个循环；最 后72℃延伸 10 min。每次试验均应设立 7种鸡球虫阳性对照和阴性对照。 6.4 琼脂糖凝胶电泳 用1×TAE缓冲液配制 3%琼脂糖凝胶，取 10 µ L PCR 反应产物与 1 µ L的上样缓冲液混合均匀，用微 量移液器将 产物加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，同时加入 DNA Marker 、阴性对照和阳性对照，进行琼 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 269—2025 3 脂糖凝胶电泳，电泳程序为恒压 120 V，时间 30 min，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统下成像，观 察结果并保存图片。 7 结果判定 7.1 阳性对照出现附录 B表B.1所示 7种鸡球虫对应大小的条带，同时阴性对照 组未扩增出条带时 ， 试验成立。 7.2 阳性对照未出现 附录 B表B.1所示 7种鸡球虫对应大小的条带， 并且 /或者阴性对照组扩增出条带 时，则试验不成立。 7.3 在试验成立的前提下，被检样品出现附录 B表B.1所示的某种或某些 球虫的目的条带 时，判为相 应鸡球虫阳性。 7.4 在试验成立的前提下，被检样品未出现 任何种球虫的目的条带 时，判为 7种鸡球虫阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 269—2025 4 附 录 A （资料性） 7种鸡球虫孢子化卵囊形态 7种鸡球虫孢子化卵囊形态如图 A.1所示。 标引序号说明： a——巨型艾美耳球虫； b——布氏艾美耳球虫； c——柔嫩艾美耳球虫； d——毒害艾美耳球虫； e——早熟艾美耳球虫； f——堆型艾美耳球虫； g——和缓艾美耳球虫。 图A.1 7种鸡球虫孢子化卵囊形态 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台